眼科抗菌藥物加替沙星和利福平對人角膜上皮細胞的凋亡誘導作用研究.pdf

1、人的角膜位于眼球的最前端，而角膜上皮層又位于角膜的最外側，是抵御外界病原體入侵的第一道防線，極易受到感染，引發(fā)角膜炎癥，影響患者視力的準確性。加替沙星和利福平是目前眼科中治療角膜炎癥常用的抗生素類抗菌藥物，隨著應用的普及，加替沙星和利福平是否具有細胞毒性作用等問題引起越來越多的關注和重視，越來越多的研究建議降低使用濃度和劑量。但目前仍未見有關于加替沙星和利福平對人角膜上皮(HCEP)細胞毒性作用的詳細報道，本實驗以實驗室自建的非轉染、無

2、致瘤性的HCEP細胞系為研究體系，研究了加替沙星和利福平對HCEP細胞的凋亡誘導作用。
　　為了驗證加替沙星對HCEP細胞的凋亡誘導作用，本文將臨床濃度的加替沙星溶液(3 g/L)倍比稀釋至0.1875 g/L，對體外培養(yǎng)的HCEP細胞加藥處理后發(fā)現(xiàn)濃度高于0.75 g/L的加替沙星會導致HCEP細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞發(fā)生皺縮變圓，甚至脫壁死亡。這說明0.75～3 g/L濃度的加替沙星對HCEP細胞有比較明顯的毒性作用，且具有

3、時間和濃度依賴性。為了探究加替沙星對HCEP細胞的毒性作用機理，本文用0.1875～3 g/L梯度稀釋的加替沙星處理HCEP細胞，然后進行吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光雙染色實驗，結果發(fā)現(xiàn)濃度高于0.75 g/L時加替沙星能顯著提高HCEP細胞質膜的通透性，且加替沙星對HCEP細胞的毒性作用有明顯的濃度和時間依賴性，提示這種毒性作用可能是凋亡誘導作用。通過對加替沙星處理后的HCEP細胞基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，1.5 g

4、/L的加替沙星處理HCEP細胞28h和32h均出現(xiàn)了典型、清晰的梯狀條帶，細胞核DNA發(fā)生大規(guī)模片段化。透射電鏡觀察結果顯示細胞結構出現(xiàn)紊亂，細胞質中出現(xiàn)空泡化，染色質出現(xiàn)固縮并邊緣化，并有凋亡小體的形成等典型的細胞凋亡特征,表明加替沙星對 HCEP細胞的毒性作用是凋亡誘導作用。進行Annexin-VFITC檢驗發(fā)現(xiàn)，1.5 g/L加替沙星處理4h后的HCEP細胞即進入早期凋亡狀態(tài)，24h后大部分細胞進入晚期凋亡狀態(tài)。通過檢測加替沙星處

5、理后的HCEP細胞的線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)HCEP細胞線粒體膜電位會被去極化，揭示HCEP細胞在加替沙星的誘導下可能通過線粒體途徑發(fā)生凋亡。
　　為驗證利福平對 HCEP細胞的凋亡誘導作用，本文將臨床濃度的利福平溶液(0.5 g/L)倍比稀釋到31.25 mg/L，對體外培養(yǎng)的HCEP細胞進行處理后，觀察發(fā)現(xiàn)利福平濃度高于0.125 g/L時，HCEP細胞皺縮，出現(xiàn)明顯的空泡化，甚至脫壁等現(xiàn)象,表明濃度高于0.125 g/L的利福平溶

6、液對HCEP細胞有顯著的毒性作用，且有明顯的時間和濃度依賴性。為了進一步研究利福平對HCEP細胞毒性作用的機理，本文對利福平處理過的HCEP細胞進行AO/EB熒光雙染色實驗發(fā)現(xiàn)HCEP細胞的質膜通透性顯著提高，提示利福平對HCEP細胞的毒性作用可能是凋亡誘導作用。通過DNA瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，經過0.5 g/L的利福平處理32 h后的HCEP細胞基因組DNA出現(xiàn)了清晰典型的梯狀條帶，細胞核DNA發(fā)生大規(guī)模片段化。電鏡下HCEP細胞呈現(xiàn)出

7、結構紊亂、空泡化、染色質邊緣化等凋亡特征，揭示利福平對HCEP細胞的毒性作用是凋亡誘導作用。流式細胞儀的檢測結果表明，1.5 g/L的利福平處理6h后的HCEP細胞即進入早期凋亡狀態(tài)，24h后大部分HCEP細胞進入了晚期凋亡狀態(tài)。而線粒體膜電位的檢測結果表明，HCEP細胞在利福平誘導下線粒體膜電位被去極化，其凋亡與線粒體相關。
　　本文以自主建立的非轉染、無致瘤性的HCEP細胞系為研究體系，進行了眼科抗菌藥物加替沙星和利福平對HC