抗菌滴眼液左氧氟沙星和利福平對(duì)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、人角膜主要由內(nèi)皮、基質(zhì)和上皮及其衍生物等組成，角膜內(nèi)皮細(xì)胞（HCEC）在成年后不具有再生能力，外科創(chuàng)傷或者疾病的治療如青光眼的治療、糖尿病等都會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的減少，導(dǎo)致視力減弱。抗菌滴眼液在臨床上的使用非常廣泛，主要用來治療角膜炎、結(jié)膜炎、沙眼等眼部疾病。本文研究對(duì)象左氧氟沙星和利福平是常用的兩種抗菌滴眼液，臨床濃度分別為4.88 g/L和0.5 g/L。左氧氟沙星滴眼液主要用于治療細(xì)菌性結(jié)膜炎和角膜炎，利福平滴眼液主要用于治療沙眼

2、等眼表炎癥。左氧氟沙星（Levofloxacin）是喹諾酮類抗生素氧氟沙星的左旋體，通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻止細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制，最終殺死細(xì)菌。利福平（Rifampicin）與細(xì)菌的RNA聚合酶結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抗菌作用?？咕窝垡簩?duì)角膜是否存在毒性作用日益受到研究者的關(guān)注。Skelnik指出使用鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記的方法，測(cè)定不同濃度左氧氟沙星溶液培養(yǎng)人角膜內(nèi)皮（HCE）細(xì)胞和基質(zhì)（HCK）細(xì)胞一定時(shí)間后的細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)左氧

3、氟沙星對(duì)HCE細(xì)胞和HCK細(xì)胞的毒性具有時(shí)間和濃度依賴性（Skelnik等，2003），但未闡明毒性產(chǎn)生的機(jī)制。目前利福平滴眼液常見于文獻(xiàn)報(bào)道的多為引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，如丘疹等。本文利用實(shí)驗(yàn)室自建的人角膜內(nèi)皮（HCE）細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材料，通過光鏡觀察、AO/EB熒光雙染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳和透射電鏡等方法系統(tǒng)研究了左氧氟沙星和利福平對(duì)體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞的影響作用，并且以家貓為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了體內(nèi)毒性作用研究，為兩種抗菌滴眼液對(duì)HCE

4、細(xì)胞的毒性作用的評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　觀察不同濃度左氧氟沙星（0.1525g/L~4.88g/L）處理的HCE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)拉伸變長(zhǎng)、細(xì)胞間連接消失、皺縮變圓、脫壁死亡等形態(tài)變化，說明左氧氟沙星對(duì)HCE細(xì)胞具有毒性作用。吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）熒光雙染色結(jié)果顯示，左氧氟沙星能誘導(dǎo)HCE細(xì)胞死亡且凋亡率具有濃度和時(shí)間依賴性，說明左氧氟沙星能夠顯著提高HCE細(xì)胞質(zhì)膜通透性。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果證實(shí)左氧氟沙星能夠誘導(dǎo)HC

5、E細(xì)胞核DNA發(fā)生斷片化。4.88g/L左氧氟沙星處理12h后HCE細(xì)胞的透射電鏡照片結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)紊亂、染色質(zhì)固縮、凋亡小體等細(xì)胞凋亡特征。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，2.44g/L~4.88g/L的左氧氟沙星能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　不同濃度利福平（0.03125g/L~0.5g/L）處理的HCE細(xì)胞出現(xiàn)了生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞間連接消失、細(xì)胞拉伸變長(zhǎng)、胞質(zhì)空泡化形態(tài)學(xué)變化，說明利福平對(duì)HCE細(xì)胞具有毒性作用。吖啶橙

6、/溴乙錠（AO/EB）熒光雙染色結(jié)果顯示，利福平能誘導(dǎo)HCE細(xì)胞死亡且凋亡率具有濃度和時(shí)間依賴性，說明利福平能提高HCE細(xì)胞膜的通透性。DNA瓊脂糖凝膠電泳證明利福平能夠誘導(dǎo)HCE細(xì)胞核DNA發(fā)生斷片化。0.5g/L利福平處理HCE細(xì)胞16h的透射電鏡照片顯示，細(xì)胞出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)紊亂、染色質(zhì)固縮邊緣化、凋亡小體等細(xì)胞凋亡的超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，0.25g/L~0.5g/L利福平能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　為了

7、驗(yàn)證左氧氟沙星與利福平對(duì)在體角膜內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，本實(shí)驗(yàn)利用家貓進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過內(nèi)皮鏡、茜素紅染色和掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，每天4次結(jié)膜下滴入左氧氟沙星或利福平滴眼液，導(dǎo)致家貓角膜內(nèi)皮部分區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞密度下降、面積增大、非六邊形比例增大、喪失完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞皺縮等毒性作用。證明臨床濃度左氧氟沙星和利福平對(duì)CCE細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用。
　　本文首次利用體外培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系證明了左氧氟沙星和利福平對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的毒