Apoptin對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用研究.pdf

1、膀胱移行細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居高不下，臨床上主要以手術(shù)、放化療和免疫治療為主，雖能明顯的延長患者的生存期，但因其具有多發(fā)和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，遠(yuǎn)期療效及患者生活質(zhì)量并不令人滿意，尤其是中、晚期患者，往往喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)。作為一種有望徹底治愈腫瘤的治療方式，腫瘤基因治療雖然開展較晚，卻擁有廣闊的前景。近年來，伴隨分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展及各種癌基因、抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，腫瘤基因治療獲得了極大進(jìn)步，并取得了可喜的成績。腫瘤基因治

2、療的關(guān)鍵是靶向性殺傷，既要有效殺傷腫瘤細(xì)胞，又不能殺傷或干擾正常細(xì)胞。缺乏腫瘤細(xì)胞靶向性是限制基因治療不能廣泛應(yīng)用于臨床的瓶頸。具有特異性腫瘤殺傷作用的基因是腫瘤基因治療的理想選擇。 Apoptin是由雞貧血病毒VP3基因編碼的凋亡功能蛋白，包含121個(gè)氨基酸，分子量為13.6KD，不與任何已知蛋白同源。研究表明，Apoptin具有廣譜的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)，能誘導(dǎo)卵巢癌、肝癌、惡性淋巴瘤等多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常淋巴、真皮、

3、上皮、內(nèi)皮等人正常和原代二倍體細(xì)胞無殺傷及毒性作用，尤其是對(duì)化療藥物及放射治療極為敏感的二倍體細(xì)胞，如骨髓來源的造血干細(xì)胞CD34+和間葉干細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，均不受Apoptin誘導(dǎo)的凋亡影響，不同途徑給藥亦未發(fā)現(xiàn)Apoptin的毒性效應(yīng)，這均說明其具有潛在的抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究將此外源性基因引入膀胱癌的基因治療，構(gòu)建能表達(dá)Apoptin的真核表達(dá)質(zhì)粒，以EGFP為報(bào)告基因，脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞，從體外培養(yǎng)

4、和移植瘤模型兩方面研究Apoptin對(duì)膀胱癌的治療作用，并對(duì)其與化療藥物順鉑的聯(lián)合應(yīng)用可行性做初步探討。 研究目的： 1.探討Apoptin對(duì)體外培養(yǎng)的T24細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響。 2.探討Apoptin對(duì)人膀胱癌裸鼠移植瘤的治療作用。 3.探討Apoptin與化療藥物順鉑對(duì)T24的協(xié)同殺傷作用。 研究內(nèi)容和方法： 1.EGFP標(biāo)記的Apoptin真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：以變異

5、型Apoptin質(zhì)粒p3×flag-m-Apoptin-myc為模板，根據(jù)NCBIGenBank登錄的野生型Apoptin基因序列設(shè)計(jì)引物，矯正變異堿基，擴(kuò)增出野生型Apoptin基因片斷，并將其定向克隆于以EGFP作為報(bào)告基因的載體pEGFP-N1中，構(gòu)建能表達(dá)Apoptin-EGFP融合蛋白的重組質(zhì)粒pApoptin-EGFP，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、電泳初步確認(rèn)，送上海生工測序鑒定。 2.Apoptin對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的誘導(dǎo)凋

6、亡作用：脂質(zhì)體介導(dǎo)，將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，RT-PCR檢測ApoptinmRNA表達(dá)，倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白表達(dá)，MTT檢測轉(zhuǎn)染后不同時(shí)相點(diǎn)T24增殖抑制，凋亡光學(xué)試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞形態(tài)變化和凋亡率，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率和細(xì)胞周期。 3.Apoptin對(duì)膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的治療作用：皮下注射T24.細(xì)胞，建立人膀胱移行細(xì)胞癌裸鼠移植瘤模型，于腫瘤直徑0.5cm大小時(shí)，采用多點(diǎn)注射的方法，將脂質(zhì)體包裹的

7、質(zhì)粒pApoptin-EGFP導(dǎo)入T24裸鼠移植瘤，設(shè)立空質(zhì)粒組、生理鹽水組作為對(duì)照組，觀察裸鼠及移植腫瘤生長情況；5周后處死荷瘤鼠，繪制移植瘤生長曲線，計(jì)算抑瘤率，腫瘤組織石蠟包埋，常規(guī)切片，H.E.染色觀察組織細(xì)胞形態(tài)，TUNEL法檢測移植瘤組織細(xì)胞調(diào)亡。 4.Apoptin與順鉑(DDP)對(duì)T24細(xì)胞的殺傷及協(xié)同作用：梯度濃度的順鉑作用于轉(zhuǎn)染pApoptin-EGFP和空質(zhì)粒的T24.細(xì)胞，MTT法檢測順鉑作用24小時(shí)后T

8、24細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測凋亡，金氏法判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與順鉑干預(yù)是否具有協(xié)同作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.通過酶切電泳及測序鑒定，確認(rèn)已成功擴(kuò)增出野生型Apoptin基因，與GenBank登陸序列完全一致，在EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)間正確插入pEGFP-N1載體內(nèi)，方向及編碼序列正確，與EGFP編碼序列構(gòu)成完整閱讀框，無移碼突變，成功構(gòu)建理論上能表達(dá)Apoptin.EGFP融合蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pApoptin-EGFP。

9、 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24.細(xì)胞后，RT-PCR檢測到ApoptinmRNA表達(dá)；熒光顯微鏡下可見綠色熒光，說明融合蛋白能在真核細(xì)胞T24中順利表達(dá)；MTT檢測T24細(xì)胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染apoptin對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞生長具有明顯抑制作用，24h、48h、72h抑制率分別(19.4±3.76)％，(37.5±4.66)％和(49.5±4.15)％；與空質(zhì)粒對(duì)照組相比，抑制率顯著增高。經(jīng)過凋亡光學(xué)試劑盒檢測，Apo

10、ptin的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可引起細(xì)胞核高度凝聚，染色質(zhì)密集、呈邊緣化等凋亡特征性表現(xiàn)，經(jīng)計(jì)數(shù)，凋亡率約為(21.25±1.98)％，而空質(zhì)粒組僅為(7.3±1.04)％。流式細(xì)胞儀Annexin-Ⅴ/PⅠ法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率和凋亡，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，pApoptin-EGFP組早期調(diào)亡率為(18.7±1.13)％，pEGFP-N1組為(4.97±0.57)％，兩者具有非常顯著差異(P＜0.01)；晚期調(diào)亡細(xì)胞Apoptin組為(19.2±1.99)％

11、，較對(duì)照組(2.7±1.73)％同樣有非常顯著的提高，進(jìn)一步說明Apoptin能顯著誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀檢測24h、48h、72h三個(gè)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞周期變化，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒24h可引起S期細(xì)胞減少，G1、G2/M期輕度阻滯，隨時(shí)間推移，以上變化逐漸減弱，72小時(shí)基本接近空白對(duì)照組，而轉(zhuǎn)染pApoptin-EGFP重組質(zhì)粒的T24細(xì)胞S期細(xì)胞比例顯著減少，并隨時(shí)間推移，變化逐漸加大，72小時(shí)尤為明顯，已由46.8％持續(xù)下降到28

12、.5％，G1/G0和G2/M期均有上升，呈現(xiàn)雙阻滯現(xiàn)象。 3.成功構(gòu)建人膀胱移行細(xì)胞癌裸鼠移植瘤模型；注射pApoptin-EGFP質(zhì)粒的荷瘤鼠精神狀態(tài)較好，飲食正常，體重增加，無消瘦等惡病質(zhì)表現(xiàn)；腫瘤體積小，形態(tài)較規(guī)則，生長緩慢，處死剝離時(shí)與周圍組織無明顯粘連，凈重平均為0.26±0.08g。生理鹽水組和空白質(zhì)粒組荷瘤鼠精神狀態(tài)差，不喜活動(dòng)，食欲差，毛色晦暗，消瘦；腫瘤生長速度較快，形態(tài)欠規(guī)則，處死剝離時(shí)與周圍組織明顯粘連，凈

13、重分別為1.02±0.23g和0.83±0.20g。以生理鹽水組作對(duì)照，pApoptin-EGFP質(zhì)粒注射組和空質(zhì)粒組腫瘤抑制率分別為74.5％和18.6％，兩者差異明顯。三組移植瘤組織切片H.E染色提示三組細(xì)胞核大、深染，組織結(jié)構(gòu)紊亂，符合腫瘤細(xì)胞特征，pApoptin-EGFP質(zhì)粒注射組染色質(zhì)濃縮、聚集的細(xì)胞明顯增多；TUNEL染色示pApoptin-EGFP、pEGFP-N1、生理鹽水三組凋亡率分別為(23.24±6.12)％，(

14、3.52±1.20)％和(1.76±0.44.)％，pApoptin-EGFP注射組與空白質(zhì)粒注射組、生理鹽水注射組相比，凋亡率有非常顯著差異。說明Apoptin作為外來基因產(chǎn)物對(duì)人膀胱癌T24裸鼠移植瘤具有明顯的抑瘤作用，治療期間未見明顯的毒、副作用。 4.隨順鉑(DDP)濃度的增加，DDP、pEGFP-N1+DDP、pApoptin-EGFP+DDP三組T24細(xì)胞抑制率逐漸增高；除64ug/ml濃度組外每個(gè)劑量點(diǎn)的pApop

15、tin-EGFP+DDP組IR值均比：DDP、pEGFP-N1+DDP組為高，差異顯著，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；64ug/ml組因抑制效應(yīng)已屬平臺(tái)期，故僅呈增高趨勢，卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)計(jì)算，DDP、pEGFP-N1+DDP和pApoptin-EGFP+DDP三組的：IC50分別為10.61ug/ml，7.9ug/ml和2.4ug/ml；經(jīng)金氏法計(jì)算和分析，確認(rèn)pApoptin-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與DDP干預(yù)對(duì)T24的抑制增殖效應(yīng)具有

16、協(xié)同作用，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與DDP干預(yù)的作用僅為簡單相加；同法分析可見pApoptin-EGFP和DDP誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡效應(yīng)同樣具有協(xié)同作用，而空質(zhì)粒與DDP誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)僅為簡單相加。 結(jié)論： 1.構(gòu)建了pApoptin-EGFP重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒能在膀胱癌T24細(xì)胞中順利表達(dá)Apoptin-EGFP融合蛋白。 2.與空質(zhì)粒相比，Apoptin能明顯的抑制T24細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1/G0和