人甘露聚糖結(jié)合凝集素糖識別域?qū)Σ≡w的直接效應(yīng)研究.pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)為肝細(xì)胞分泌的一種血清糖蛋白，屬于C型凝集素超家族中膠凝素家族的成員，是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識別分子。成熟MBL肽鏈自N端至C端依次有富含Cys的N端區(qū)、膠原樣區(qū)(CLR)、頸區(qū)和C端糖識別域(CRD)。MBL在機體抗感染天然免疫中起重要作用。它利用CRD選擇性識別和結(jié)合多種病原體表面以D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖等為末端糖基的糖結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)CRD能識別和結(jié)合細(xì)菌

2、、病毒、酵母、利什曼原蟲等一系列病原體。MBL又籍其CLR經(jīng)由凝集素途徑激活補體系統(tǒng)，發(fā)揮溶菌或間接調(diào)理吞噬功能；還能與吞噬細(xì)胞表面的膠凝素受體(即C1q受體)結(jié)合，起直接調(diào)理作用。 目前，關(guān)于MBL分子CRD的研究，生化學(xué)家著眼于其糖識別的分子機制，免疫學(xué)家則集中于CRD的微生物識別譜，而沒有考慮CRD是否還有其它功能。近年來有研究提示，MBL能抑制流感病毒感染細(xì)胞，且這一作用不依賴補體；MBL還能干擾病毒粘附到宿主細(xì)胞，影響

3、病毒的傳播和釋放。但未對這種作用與MBL結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行研究。認(rèn)為，也許正如抗體的Fab片段除了識別抗原外還有中和毒素、中和病毒作用一樣，MBL的CRD特別是具有較高親和力的寡聚CRD可能具有中和病毒及阻抑細(xì)菌粘附等直接效應(yīng)功能。 為了探索上述可能性，本研究中，將MBL-CRD基因在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，獲得純化的重組CRD多聚體蛋白，在對其配體結(jié)合活性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，初步研究了MBL-CRD對病原體的直接效應(yīng)。 一、

4、多聚化重組人MBL糖識別域的制備 采用基因工程技術(shù),以含有漢族人野生型MBL全長編碼區(qū)cDNA的質(zhì)粒pGEM-MBL為模板，擴(kuò)增出長度為447bp的人MBL頸區(qū)及CRD基因片段，將其克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，導(dǎo)入大腸桿菌，以IPTG誘導(dǎo)重組pGEX4T-CRD質(zhì)粒表達(dá)GST-CRD融合蛋白。對以包涵體形式存在的GST-CRD融合蛋白經(jīng)8mol/L脲變性、梯度復(fù)性，獲得結(jié)構(gòu)折疊正確的重組蛋白；經(jīng)GSTrap層析柱進(jìn)一

5、步純化后，在Ca2+存在的條件下，反復(fù)透析形成多聚體蛋白。又經(jīng)凝血酶酶切，獲得了純化的CRD蛋白，但產(chǎn)率較低。 二、人MBL-CRD融合蛋白的配體結(jié)合活性研究 用ELISA和形態(tài)學(xué)的方法對重組GST-CRD融合蛋白的配體結(jié)合活性進(jìn)行了鑒定。使用甘露糖、甘露聚糖、甘露糖胺、半乳糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺等6種糖和大腸桿菌、福氏痢疾桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、Ⅰ型肺炎球菌及甲型流感病毒等5種病原體進(jìn)行配體結(jié)合試驗。ELISA分

6、析發(fā)現(xiàn)，GST-CRD融合蛋白能與糖基配體及多種病原體有效結(jié)合，且融合蛋白與大腸桿菌的結(jié)合可被甘露聚糖所抑制。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的GST-CRD蛋白與細(xì)菌在37℃反應(yīng)1h后，在熒光顯微鏡下可見熒光著色的細(xì)菌凝集成塊，且這種作用是Ca2+依賴的。因此，我們制備的GST-CRD融合蛋白具有MBL-CRD蛋白的配體結(jié)合活性。 三、人MBL-CRD對病原體的直接效應(yīng)研究 選?、蛐头闻萆掀ぜ?xì)胞系A(chǔ)549和大腸上皮細(xì)胞系L

7、ovo分別作為Ⅰ型肺炎球菌(G+細(xì)菌)和福氏痢疾桿菌(G-細(xì)菌)的靶細(xì)胞，對GST-CRD融合蛋白能否阻抑其黏附的直接效應(yīng)功能進(jìn)行了初步研究。通過粘附的時間曲線和劑量曲線可以看出，F(xiàn)ITC標(biāo)記細(xì)菌粘附靶細(xì)胞的過程是特異的。將不同稀釋度的GST-CRD融合蛋白與細(xì)菌于37℃作用1h后，加入到靶細(xì)胞粘附3h，洗滌后后用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)融合蛋白濃度逐漸降低時，粘附至靶細(xì)胞上的FITC標(biāo)記的病原體明顯增多。軟件分析粘附細(xì)菌數(shù)，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分