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文檔簡介
1、背景與目的:
白血?。↙eukemial)是由于造血干細(xì)胞不受機體基因調(diào)控,從而惡性克隆所形成的疾病,這些惡性克隆細(xì)胞大量增生累積,抑制正常造血細(xì)胞,同時廣泛浸潤肝、脾、淋巴結(jié)等各種臟器。白血病細(xì)胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙及凋亡受阻,從而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。臨床表現(xiàn)為貧血(通常為正細(xì)胞正色素性貧血)、出血(血小板低下)、感染(粒細(xì)胞缺乏)和浸潤(通常受累脾、淋巴結(jié))等征象。根據(jù)惡性增殖的細(xì)胞系大致可將AL分為急性
2、淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia1)和急性髓系細(xì)胞白血?。ˋcute myeloid Leukemia1)。根據(jù)增殖的白血病細(xì)胞免疫表型,ALL又可分為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型和T/B混合型。其中T細(xì)胞型ALL(T-ALL)是以T細(xì)胞增殖失控,大量分化障礙的 T細(xì)胞惡性克隆性增生、積聚,從而大量 T細(xì)胞浸潤組織為特征的血液系統(tǒng)惡性疾病,占ALL的15%-25%,有別于B細(xì)胞型ALL,它具有獨特的臨床表現(xiàn)
3、、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等特點。T-ALL患者預(yù)后相對其他類型白血病差,特別是一些患兒。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,多種抗腫瘤藥聯(lián)合化療的方案及大劑量化療的臨床應(yīng)用,使得 T-ALL患者預(yù)后有了很大改善,但仍有部分患者即使大劑量化療也不能達(dá)到完全緩解,T-ALL難治性問題是血液科臨床醫(yī)師面臨的最大挑戰(zhàn)。所以說,T-ALL的治療仍是目前白血病治療的難點和重點。
地西他濱(Decitabine,DAC)作為新型抗腫瘤藥物,屬于DNA甲
4、基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑,其研究發(fā)現(xiàn),DAC本身也是去甲基化藥物,且具有酶的特異性。目前研究熱點多集中于 DAC在白血病中發(fā)揮的去甲基化作用,從而達(dá)到治療目標(biāo),國外最新研究發(fā)現(xiàn),DAC亦能參與多種信號傳導(dǎo)路徑活化過程,如 JAK-STAT,表明可能通過其他途徑發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,但關(guān) DAC促凋亡的研究,國內(nèi)外甚少。
TAL1(T cell acute lymphoblastic leukemia1)基因位于染色體的1p32,它
5、對調(diào)控造血干細(xì)胞的發(fā)育以及各系血細(xì)胞的分化形成起著至關(guān)重要的作用。TAL1基因是急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL)患者中最常見的染色體重排靶標(biāo),越來越多的研究支持TAL1基因在白血病的發(fā)病過程中扮演者不可或缺的角色。盡管TAL1基因最初是在發(fā)生了染色體易位的T-ALL病人中發(fā)現(xiàn),但隨后研究表明,其在正常血細(xì)胞分化過程中擔(dān)任了不可或缺的角色。動物實驗研究表明, TAL1的發(fā)育起始于老鼠胚胎的8.5天,隨后在上皮組織及神經(jīng)組織中表達(dá),在紅系
6、及巨噬系細(xì)胞中也有表達(dá);研究人員在敲除了TAL1基因后,老鼠均在9.5天左右死亡,同時發(fā)現(xiàn)缺失TAL1基因的老鼠,造血組織受到了不可恢復(fù)的影響,均停滯發(fā)育、分化,從而造成小鼠死亡。臨床研究表明,多于60%的T-ALL病人中,TAL1表達(dá)水平是升高的,提示它對腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展起重要作用。然而,是什么原因?qū)е铝薚AL1的高表達(dá),至今仍未清楚。本實驗選擇不同濃度的DAC作用于白血病Jurkat細(xì)胞系,觀察其對Jurkat細(xì)胞系的增殖、凋亡及對
7、TAL1基因表達(dá)的影響。為DAC治療T-ALL提供實驗室依據(jù)。
材料與方法:
1.WST-1測細(xì)胞增值率:采用終濃度為0.5、1、5、10μmol/L的DAC作用于Jurkat細(xì)胞24h、48、72h,確定地西他濱作用于細(xì)胞的適宜濃度與時間。2.觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:以0μmol/L及5μmol/L DAC作用于Jurkat細(xì)胞48h,熒光倒置顯微鏡下觀察。3.通過Real-time RT-PCR實驗方法分析檢測檢測實
8、驗組Jurkat細(xì)胞及空白對照組TAL1mRNA表達(dá)。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:5μmol/L DAC作用于Jurkat細(xì)胞48h后,用AnnexinV-FITC/PI雙染色法通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
結(jié)果:
1.WST-1結(jié)果顯示:不同濃度的DAC對Jurkat細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用。DAC終濃度為0.5、1、5、10μmol/L,作用于Jurkat細(xì)胞24h,對Jurkat細(xì)胞增殖均有抑制作用,其抑
9、制率分別為(13.8±1.15)%、(25.8±0.93)%、(41.6±2.01)%、(49.5±0.48)%;各濃度組與空白對照組(1.70±0.25)%比較,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);不同濃度組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 DAC5μmol/L作用于Jurkat細(xì)胞24、48、72h,對Jurkat細(xì)胞生長有明顯抑制作用,抑制率分別為(41.6±2.01)%、(55.8±1.22)%和(59.6±2.1
10、3)%,組間兩兩比較,24h與48h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);48h與72h組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此計算出地西他濱處理Jurkat細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50值)接近于5μmol/L因此選擇其為實驗組進(jìn)行后續(xù)試驗。
2.觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:根據(jù)WST-1實驗得出DAC最佳作用時間及IC50值,以0μmol/L及5μmol/L DAC作用于Jurkat細(xì)胞48h,熒光倒置顯微鏡下觀察,5μmol/
11、L實驗組較0μmol/L對照組細(xì)胞核明顯出現(xiàn)變形、濃縮、腎形核及花瓣樣改變,說明DAC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。
3.通過實時熒光定量PCR法分析檢測出實驗組Jurkat細(xì)胞系中TAL1mRNA表達(dá)水平明顯降低(0.375±0.0156),與對照組相比較(1.038±0.049),差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002;t=12.92)。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:Annexin V和PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)
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