靶向Survivin的siRNA對胰腺癌細胞增殖及對吉西他濱化療敏感性影響.pdf

1、胰腺癌是預后極差的人體惡性腫瘤之一。胰腺癌患者早期癥狀不明顯，確診時多數(shù)已屬晚期，往往已失去手術(shù)時機，五年生存率不到5%。包括化療在內(nèi)的綜合治療是提高胰腺癌患者生存率的關(guān)鍵，但現(xiàn)有的化療藥物大多對胰腺癌不敏感。吉西他濱是一種新型的嘧啶類抗代謝藥物，是目前治療胰腺癌的主要藥物之一，它能緩解臨床癥狀，然而并不能明顯延長患者生存時間，化療耐藥是導致治療失敗的主要原因。因此，解決胰腺癌細胞的化療耐藥已經(jīng)成為臨床上迫切需要解決的實際問題。近年來隨

2、著分子生物學研究的深入發(fā)展，以凋亡抑制蛋白為靶點的基因治療備受關(guān)注，目前的實驗研究已經(jīng)取得了初步的成效和進展，可能為有效提高胰腺癌治療效果提供了一個新的方向。
　　 研究表明，Survivin作為一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)，具有抗凋亡和調(diào)節(jié)細胞周期的雙重功能，在人類眾多惡性腫瘤中廣泛表達，而在正常組織中不表達或低表達。Survivin是至今克隆出的最小IA

3、P，定位于染色體17q25，其基因全長14.7kb，在G2/M期特異性表達，編碼16.5kb的蛋白。Survivin的表達與胰腺癌患者的預后、復發(fā)以及化療耐藥密切相關(guān)。Survivin主要通過其羧基端α-螺旋結(jié)構(gòu)與有絲分裂的紡錘體微管結(jié)合，再通過BIR結(jié)構(gòu)與caspase3和caspase7特異性地結(jié)合在一起，直接抑制凋亡終末效應器caspase3和caspase7的活性，阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程。Survivin亦可抑制細胞色素

4、C從線粒體釋放，阻斷caspase激活，從而在上游阻斷凋亡信號的傳導抑制細胞凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)阻斷Survivin表達可抑制多種腫瘤細胞的生長。亦有學者實驗證實，靶向抑制Survivin表達可增強胰腺癌細胞的放療敏感性。由此我們結(jié)合Survivin的特性考慮，對Survivin基因進行阻斷有可能會成為增強胰腺癌對吉西他濱化療敏感性的一種新方法，而目前國內(nèi)外文獻尚未見相關(guān)報道。
　　 在本研究中，我們首先探討Survivin在胰

5、腺癌組織中的表達及與Bcl-2相關(guān)性研究，然后檢測化療誘導胰腺癌細胞凋亡Survivin表達的變化。構(gòu)建靶向Survivin基因的siRNA真核表達載體，將構(gòu)建的siRNA質(zhì)粒通過脂質(zhì)體導入到人胰腺癌Panc-1和BxPC3細胞中并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，觀察其對survivin的mRNA和蛋白表達抑制作用，以及對胰腺癌細胞增殖、細胞周期、細胞侵襲力和對化療藥物吉西他濱的敏感性的影響。實驗結(jié)果為今后利用靶向Survivin基因的siRNA

6、增強胰腺癌細胞的化療敏感性提供強有力的證據(jù)。本實驗共分為以下四部分。
　　 第一部分、Survivin在胰腺癌組織中的表達及與Bcl-2相關(guān)性研究
　　 目的：本研究旨在檢測人胰腺癌組織中Survivin的表達，分析其與臨床病理特征的關(guān)系及與Bcl-2表達的相關(guān)性，探討其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 材料和方法：
　　 應用免疫組織化學SP法檢測50例胰腺癌標本和14例正常胰腺組織中Survivin的

7、表達，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，探討Survivin與Bcl-2表達的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1. 50例胰腺癌標本中有31例出現(xiàn)Survivin陽性表達，陽性率為62%，而14例正常胰腺組織中均未檢測到Survivin表達(P<0.05)。
　　 2. Survivin蛋白的表達與腫瘤分化程度、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、腫瘤部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。
　　

8、 3. Bcl-2表達陽性、陰性組中Survivin的陽性表達率分別為77.8%和43.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1. Survivin在胰腺癌組織中的高表達提示其對胰腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能起重要作用，Survivin與Bcl-2的表達呈正相關(guān)，二者可能發(fā)揮協(xié)同作用。
　　 2. Survivin的高表達可作為胰腺癌預后不良的生物學指標。
　　 第二部分、化療誘

9、導胰腺癌細胞凋亡Survivin表達的變化及意義
　　 目的：研究紫杉醇體外化療對胰腺癌細胞凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA和蛋白表達的影響。
　　 材料和方法：
　　 1. 培養(yǎng)人胰腺癌細胞株SW1990，加入低濃度的紫杉醇(PA)，用流式細胞儀分別檢測對照組和加藥后24h、48h的細胞凋亡率。
　　 2. PT-PCR和免疫印跡技術(shù)(western-blot)檢測survivin基因mRNA和

10、蛋白的表達
　　 結(jié)果：
　　 1. 給予SW1990胰腺癌細胞低濃度的PA誘導后，對照組和加藥后24h和48h胰腺癌細胞凋亡率(%)分別是2.59±0.35,14.75±1.29,22.65±2.80(P<0.05)。
　　 2. 加藥后24h和48h胰腺癌細胞survivin mRNA分別比對照組提高了1.1倍和2.9倍(P<0.05)；蛋白分別提高了1.3倍和3.6倍(P<0.05)。
　　 結(jié)論：

11、
　　 紫杉醇化療可促使胰腺癌細胞內(nèi)survivin基因mRNA和蛋白的表達增加，這可能是胰腺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的因素之一。
　　 第三部分、靶向Survivin基因的siRNA真核表達載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：第一部分和第二部分顯示，胰腺癌高表達Survivin蛋白，而且化療可促使胰腺癌細胞內(nèi)Survivin基因mRNA和蛋白的表達增加，本部分擬構(gòu)建并鑒定針對survivin基因的siRNA真核表達

12、載體，為下一步胰腺癌基因治療奠定基礎。
　　 材料和方法：
　　 1. 根據(jù)Survivin基因cDNA序列，在線設計2個針對目的基因的siRNA靶序列。
　　 2. 定向克隆至真核表達載體psiRNA-hH1neo上。
　　 3. 依次用酶切法和測序法對重組體進行鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1.酶切鑒定，凝膠電泳分析，重組載體酶切后呈線性，電泳呈2700bp一條帶，與預期結(jié)果符合。

13、>　　 2. 測序結(jié)果表明，目的序列插入正確。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功構(gòu)建了針對survivin的siRNA真核表達載體，可能為胰腺癌基因治療提供一種新的治療載體。
　　 第四部分、靶向Survivin的siRNA對胰腺癌細胞增殖及對吉西他濱化療敏感性影響
　　 目的：本研究擬利用構(gòu)建的靶向survivin基因的siRNA真核表達載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株，探討其對胰腺癌細胞增殖和對吉西他濱化療

14、敏感性的影響。
　　 材料和方法
　　 1. 以psiRNA-survivin轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞Panc-1和BxPC3后，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。
　　 2. 采用RT-PCR、Western Blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細胞survivin的mRNA和蛋白表達變化。
　　 3. 體外培養(yǎng)各組胰腺癌細胞，繪制細胞生長曲線。
　　 4. 流式細胞儀檢測各組胰腺癌細胞的細胞周期。
　　

15、5. Transwell侵襲室方法檢測各組胰腺癌細胞體外侵襲力。
　　 6. 吉西他濱作用48h后，MTT檢測各組細胞的增殖活性。
　　 7. 吉西他濱作用48h后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果
　　 1. 成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin的Panc-1和BxPC3細胞系。
　　 2. 重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞系后，Panc-1和BxPC3細胞survivin的mR

16、NA分別下調(diào)了68.52%和64.32%(P<0.05)，survivin的蛋白表達分別下調(diào)了76. 68%和74. 38% (P<0.05)。
　　 3.與對照組相比，轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin組胰腺癌細胞增殖緩慢，生長曲線十分平緩，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.與對照組相比，轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin組胰腺癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，G2/M期細胞減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0

17、5)。
　　 5. 實驗組胰腺癌細胞侵襲數(shù)目比對照組明顯減少(P<0.05)。
　　 6. psiRNA-survivin能顯著增強吉西他濱對胰腺癌細胞的增殖抑制作用 (P<0.05)。
　　 7. psiRNA-survivin能顯著增強吉西他濱對胰腺癌細胞的凋亡誘導作用 (P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向Survivin的siRNA后，胰腺癌細胞survivin的mRNA和蛋白

18、表達量的明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin組胰腺癌細胞增殖緩慢，生長曲線十分平緩，細胞侵襲力明顯下降，并可明顯增強吉西他賓對胰腺癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，這表明siRNA可能通過阻斷survivin的表達而阻斷其抗凋亡作用，抑制胰腺癌細胞增殖，并增強胰腺癌對吉西他濱的化療敏感性。本次實驗結(jié)果提示靶向survivin的siRNA可以作為克服腫瘤化療耐藥的一種有效方法，其與吉西他濱聯(lián)合應用可能成為今后臨床治療胰腺癌值得探索的