靶向Survivin的siRNA對胰腺癌細(xì)胞增殖及對吉西他濱化療敏感性影響.pdf

1、胰腺癌是預(yù)后極差的人體惡性腫瘤之一。胰腺癌患者早期癥狀不明顯，確診時(shí)多數(shù)已屬晚期，往往已失去手術(shù)時(shí)機(jī)，五年生存率不到5%。包括化療在內(nèi)的綜合治療是提高胰腺癌患者生存率的關(guān)鍵，但現(xiàn)有的化療藥物大多對胰腺癌不敏感。吉西他濱是一種新型的嘧啶類抗代謝藥物，是目前治療胰腺癌的主要藥物之一，它能緩解臨床癥狀，然而并不能明顯延長患者生存時(shí)間，化療耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。因此，解決胰腺癌細(xì)胞的化療耐藥已經(jīng)成為臨床上迫切需要解決的實(shí)際問題。近年來隨

2、著分子生物學(xué)研究的深入發(fā)展，以凋亡抑制蛋白為靶點(diǎn)的基因治療備受關(guān)注，目前的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)取得了初步的成效和進(jìn)展，可能為有效提高胰腺癌治療效果提供了一個(gè)新的方向。
　　 研究表明，Survivin作為一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)，具有抗凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的雙重功能，在人類眾多惡性腫瘤中廣泛表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。Survivin是至今克隆出的最小IA

3、P，定位于染色體17q25，其基因全長14.7kb，在G2/M期特異性表達(dá)，編碼16.5kb的蛋白。Survivin的表達(dá)與胰腺癌患者的預(yù)后、復(fù)發(fā)以及化療耐藥密切相關(guān)。Survivin主要通過其羧基端α-螺旋結(jié)構(gòu)與有絲分裂的紡錘體微管結(jié)合，再通過BIR結(jié)構(gòu)與caspase3和caspase7特異性地結(jié)合在一起，直接抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase3和caspase7的活性，阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。Survivin亦可抑制細(xì)胞色素

4、C從線粒體釋放，阻斷caspase激活，從而在上游阻斷凋亡信號的傳導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)阻斷Survivin表達(dá)可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。亦有學(xué)者實(shí)驗(yàn)證實(shí)，靶向抑制Survivin表達(dá)可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性。由此我們結(jié)合Survivin的特性考慮，對Survivin基因進(jìn)行阻斷有可能會成為增強(qiáng)胰腺癌對吉西他濱化療敏感性的一種新方法，而目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 在本研究中，我們首先探討Survivin在胰

5、腺癌組織中的表達(dá)及與Bcl-2相關(guān)性研究，然后檢測化療誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡Survivin表達(dá)的變化。構(gòu)建靶向Survivin基因的siRNA真核表達(dá)載體，將構(gòu)建的siRNA質(zhì)粒通過脂質(zhì)體導(dǎo)入到人胰腺癌Panc-1和BxPC3細(xì)胞中并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，觀察其對survivin的mRNA和蛋白表達(dá)抑制作用，以及對胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲力和對化療藥物吉西他濱的敏感性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后利用靶向Survivin基因的siRNA

6、增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的化療敏感性提供強(qiáng)有力的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共分為以下四部分。
　　 第一部分、Survivin在胰腺癌組織中的表達(dá)及與Bcl-2相關(guān)性研究
　　 目的：本研究旨在檢測人胰腺癌組織中Survivin的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系及與Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性，探討其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 材料和方法：
　　 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測50例胰腺癌標(biāo)本和14例正常胰腺組織中Survivin的

7、表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，探討Survivin與Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1. 50例胰腺癌標(biāo)本中有31例出現(xiàn)Survivin陽性表達(dá)，陽性率為62%，而14例正常胰腺組織中均未檢測到Survivin表達(dá)(P<0.05)。
　　 2. Survivin蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、腫瘤部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。
　　

8、 3. Bcl-2表達(dá)陽性、陰性組中Survivin的陽性表達(dá)率分別為77.8%和43.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1. Survivin在胰腺癌組織中的高表達(dá)提示其對胰腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能起重要作用，Survivin與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)，二者可能發(fā)揮協(xié)同作用。
　　 2. Survivin的高表達(dá)可作為胰腺癌預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)。
　　 第二部分、化療誘

9、導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡Survivin表達(dá)的變化及意義
　　 目的：研究紫杉醇體外化療對胰腺癌細(xì)胞凋亡抑制蛋白survivin基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　 材料和方法：
　　 1. 培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990，加入低濃度的紫杉醇(PA)，用流式細(xì)胞儀分別檢測對照組和加藥后24h、48h的細(xì)胞凋亡率。
　　 2. PT-PCR和免疫印跡技術(shù)(western-blot)檢測survivin基因mRNA和

10、蛋白的表達(dá)
　　 結(jié)果：
　　 1. 給予SW1990胰腺癌細(xì)胞低濃度的PA誘導(dǎo)后，對照組和加藥后24h和48h胰腺癌細(xì)胞凋亡率(%)分別是2.59±0.35,14.75±1.29,22.65±2.80(P<0.05)。
　　 2. 加藥后24h和48h胰腺癌細(xì)胞survivin mRNA分別比對照組提高了1.1倍和2.9倍(P<0.05)；蛋白分別提高了1.3倍和3.6倍(P<0.05)。
　　 結(jié)論：

11、
　　 紫杉醇化療可促使胰腺癌細(xì)胞內(nèi)survivin基因mRNA和蛋白的表達(dá)增加，這可能是胰腺癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的因素之一。
　　 第三部分、靶向Survivin基因的siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：第一部分和第二部分顯示，胰腺癌高表達(dá)Survivin蛋白，而且化療可促使胰腺癌細(xì)胞內(nèi)Survivin基因mRNA和蛋白的表達(dá)增加，本部分?jǐn)M構(gòu)建并鑒定針對survivin基因的siRNA真核表達(dá)

12、載體，為下一步胰腺癌基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1. 根據(jù)Survivin基因cDNA序列，在線設(shè)計(jì)2個(gè)針對目的基因的siRNA靶序列。
　　 2. 定向克隆至真核表達(dá)載體psiRNA-hH1neo上。
　　 3. 依次用酶切法和測序法對重組體進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1.酶切鑒定，凝膠電泳分析，重組載體酶切后呈線性，電泳呈2700bp一條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。

13、>　　 2. 測序結(jié)果表明，目的序列插入正確。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功構(gòu)建了針對survivin的siRNA真核表達(dá)載體，可能為胰腺癌基因治療提供一種新的治療載體。
　　 第四部分、靶向Survivin的siRNA對胰腺癌細(xì)胞增殖及對吉西他濱化療敏感性影響
　　 目的：本研究擬利用構(gòu)建的靶向survivin基因的siRNA真核表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株，探討其對胰腺癌細(xì)胞增殖和對吉西他濱化療

14、敏感性的影響。
　　 材料和方法
　　 1. 以psiRNA-survivin轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞Panc-1和BxPC3后，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
　　 2. 采用RT-PCR、Western Blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞survivin的mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　 3. 體外培養(yǎng)各組胰腺癌細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 4. 流式細(xì)胞儀檢測各組胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　

15、5. Transwell侵襲室方法檢測各組胰腺癌細(xì)胞體外侵襲力。
　　 6. 吉西他濱作用48h后，MTT檢測各組細(xì)胞的增殖活性。
　　 7. 吉西他濱作用48h后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果
　　 1. 成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin的Panc-1和BxPC3細(xì)胞系。
　　 2. 重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系后，Panc-1和BxPC3細(xì)胞survivin的mR

16、NA分別下調(diào)了68.52%和64.32%(P<0.05)，survivin的蛋白表達(dá)分別下調(diào)了76. 68%和74. 38% (P<0.05)。
　　 3.與對照組相比，轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin組胰腺癌細(xì)胞增殖緩慢，生長曲線十分平緩，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.與對照組相比，轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin組胰腺癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，G2/M期細(xì)胞減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

17、5)。
　　 5. 實(shí)驗(yàn)組胰腺癌細(xì)胞侵襲數(shù)目比對照組明顯減少(P<0.05)。
　　 6. psiRNA-survivin能顯著增強(qiáng)吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用 (P<0.05)。
　　 7. psiRNA-survivin能顯著增強(qiáng)吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 (P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向Survivin的siRNA后，胰腺癌細(xì)胞survivin的mRNA和蛋白

18、表達(dá)量的明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)染psiRNA-survivin組胰腺癌細(xì)胞增殖緩慢，生長曲線十分平緩，細(xì)胞侵襲力明顯下降，并可明顯增強(qiáng)吉西他賓對胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，這表明siRNA可能通過阻斷survivin的表達(dá)而阻斷其抗凋亡作用，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)胰腺癌對吉西他濱的化療敏感性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示靶向survivin的siRNA可以作為克服腫瘤化療耐藥的一種有效方法，其與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可能成為今后臨床治療胰腺癌值得探索的