地西他濱對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266、淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat增殖凋亡影響的實驗研究.pdf

1、目的:地西他濱(decitabine，DAC)，是一種核苷類似物，磷酸化的地西他濱參與DNA合成，然后與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)共價結(jié)合，抑制DNMTs活性，從而達(dá)到DNA去甲基化，激活抑癌基因最終可起到腫瘤細(xì)胞分化或凋亡的作用。FDA已經(jīng)正式批準(zhǔn)地西他濱用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)。地西他濱對難治性急性髓系白血病的治療近期也屢見報道。而地西他濱對淋巴系統(tǒng)腫瘤的治療研究報道較少。
　　 國內(nèi)外研究已證實淋巴瘤患者及

2、其細(xì)胞系中存在異常的高度甲基化，經(jīng)常發(fā)生于富于CpG島的腫瘤抑制基因（如P15INK4B基因，SHP-1基因，P53基因）啟動子區(qū)，并導(dǎo)致該基因的沉默?；A(chǔ)研究表明DAC能夠誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞株Raji中P15INK4B基因去甲基化并使其表達(dá)增強，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。最近研究顯示，Gore和Garcia—Manero分別報道用5-氮胞苷和丁酸苯酯、地西他濱和丙戊酸（丁酸苯酯、丙戊酸為組蛋白乙?；敢种苿┞?lián)合用藥，對白血病和T細(xì)胞淋巴瘤患

3、者進(jìn)行一、二期臨床試驗時均顯示出明顯的協(xié)同效應(yīng)。并有研究顯示在體內(nèi)，地西他濱能增加細(xì)胞對生物治療的敏感性，如維甲酸，并增加凋亡因子的表達(dá)。
　　 多發(fā)性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)，為發(fā)生于B淋巴細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞病，依現(xiàn)在醫(yī)療水平仍未能達(dá)到治愈。T細(xì)胞淋巴瘤(T-celllymphoma)，即T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)好發(fā)于亞洲地區(qū)，與B細(xì)胞來源的NHL一樣具有侵襲性，是一種來源于T淋巴細(xì)胞的惡性克隆增殖性

4、疾病，預(yù)后更差。雖T細(xì)胞NHL經(jīng)常規(guī)治療后部分患者達(dá)到緩解，但緩解期短，短期之內(nèi)可出現(xiàn)復(fù)發(fā)或進(jìn)展，目前復(fù)發(fā)或難治性T細(xì)胞NHL，尚無標(biāo)準(zhǔn)的挽救治療方案。需尋找有效藥物及其聯(lián)合治療方案以提高T細(xì)胞淋巴瘤患者療效及改善預(yù)后。當(dāng)前表觀遺傳學(xué)對腫瘤的治療作用越來越受到關(guān)注，其中主要包括去甲基化治療。
　　 為進(jìn)一步探討地西他濱對淋巴系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞增殖及促凋亡的機制，本實驗選用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266，人類T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞株，

5、分別觀察地西他濱對U266細(xì)胞株，Jurkat細(xì)胞增殖的抑制以及誘導(dǎo)凋亡作用及影響。
　　 此外，T淋巴細(xì)胞參與免疫應(yīng)答，它們在對腫瘤細(xì)胞的殺傷以及抑制腫瘤生長中起著不可忽視的作用。T淋巴細(xì)胞可分為T輔助淋巴細(xì)胞(Th)和T殺淋巴細(xì)胞(Tc)兩大類。Th1型細(xì)胞因子包括INF-α、IL-2和腫瘤壞死因子β(tumornecrosisfactor-β，TNF-β)介導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對機體抗病毒、抗腫瘤起著重要的作用;TH2類細(xì)胞

6、因子主要包括，IL-4、IL-6、IL-10等，可能還包括IL-9，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，與抑制自身免疫、移植物耐受、抗排斥反應(yīng)有關(guān)。目前研究顯示，淋巴細(xì)胞可以通過細(xì)胞因子INF-α、TNF等活化的Th和Tc細(xì)胞進(jìn)行效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長，而大部分存在腫瘤的患者往往免疫功能很低下，據(jù)研究報道這主要原因是由于腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，而抑制了T淋巴細(xì)胞的功能。地西他濱對T淋巴細(xì)胞功能的影響，目前還未見報道。Jurkat是humanT淋巴瘤

7、細(xì)胞系，可以分泌IL4、IFN-α和IL-10，我們以Jurkat細(xì)胞為做為體外研究T細(xì)胞分化的模板，模擬地西他濱對T淋巴細(xì)胞功能的影響。檢測DAC對T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4，IL-10及INF-α水平的影響，進(jìn)而為惡性淋巴瘤患者的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、常規(guī)方法培養(yǎng)U266細(xì)胞株，人T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞株，每24小時傳代一次。選用對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗。
　　 2、CCK-8法檢

8、測不同濃度的地西他濱對U266細(xì)胞，Jurkat淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響:首先依據(jù)查詢文獻(xiàn)，我們將DAC的濃度設(shè)置為(1、2、3、5、10、20、50、100、150、200、250、500μg/ml)分別作用于上述兩種細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實驗，我們分別算出作用兩種細(xì)胞兩藥48h細(xì)胞增殖抑制50％的藥物濃度(IC50)，并根據(jù)兩種細(xì)胞的IC50，我們選用附近濃度得出50、100、250μg/ml作用于U266細(xì)胞;得出2、5、10μg/mL于作用Ju

9、rkat細(xì)胞。分別作用24h、48h、72h觀察U266細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞的抑制率
　　 3、AnnexinV/PI雙染法檢測不同濃度的地西他濱對U266細(xì)胞，Jurkat淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響，藥物作用濃度同CCK-8實驗，觀察單藥作用24h、48h、的凋亡率;
　　 4、應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)實驗，藥物作用濃度同CCK-8實驗，觀察地西他濱作用48h的Jurkat淋巴瘤細(xì)胞分泌IL-4，IL-10及INF-

10、α細(xì)胞因子的表達(dá)量變化;
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析:SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，分組資料的表示用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組比較應(yīng)用t檢驗，多組比較應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05為有差異，提示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、地西他濱對U266細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡的影響
　　 CCK-8法檢測顯示，不同濃度的DAC作用24h、48h、72h后的U266細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以抑制細(xì)胞增值，增殖抑制率由23.6±0.1

11、2％增加到65.06±0.03％，呈劑量和時間的依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，DAC作用于U266細(xì)胞，隨時間延長和藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率由9.7±0.74％增加到69.4±0.24％。DAC促U266細(xì)胞凋亡呈時間劑量依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、地西他濱對Jurkat細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋

12、亡的影響
　　 CCK-8法檢測顯示，不同濃度的DAC作用24h、48h、72h后的U266細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以抑制細(xì)胞增值，增殖抑制率由17.53±0.02％增加到83.63±0.57％，呈劑量和時間的依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，DAC作用于Jurkat細(xì)胞，隨時間延長和藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率由9.7±0.74％增加到69.4±0.24％。DAC促Jur

13、kat細(xì)胞凋亡呈時間劑量依賴性。對照組與處理組及處理組之間統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、地西他濱對Jurkat細(xì)胞功能的影響
　　 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法分析結(jié)果顯示，地西他濱可誘導(dǎo)促進(jìn)Jurkat細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，低濃度組地西他濱可明顯促進(jìn)IL-4分泌，Th1/Th2比值下降，增強免疫耐受功能;中、高濃度組地西他濱可明顯促進(jìn)INF-α分泌，Th1/Th2比值明顯上升，增強抗腫瘤功能。統(tǒng)計學(xué)分析顯示空

14、白對照組與處理組之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)
　　 結(jié)論:
　　 1、地西他濱可抑制U266細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)U266細(xì)胞凋亡，呈時間和劑量依賴性。
　　 2、地西他濱可抑制Jurkat淋巴瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)Jurkat細(xì)胞凋亡，呈時間和劑量依賴性。
　　 3、地西他濱可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-4，IL-10及INF-α細(xì)胞因子，低濃度組地西他濱可使Th1/Th2比值下降，增強免疫耐受功能。中高濃度組