吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞干性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:吉西他濱處理增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的干性特征
　　目的：研究吉西他濱處理對(duì)胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC-3的干性能力及相關(guān)生物學(xué)特征的影響
　　方法：通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的吉西他濱處理對(duì)胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC-3的殺傷能力；選擇較低的不同濃度吉西他濱（1-10μM）處理SW1990、BxPC-3細(xì)胞系，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD24及CD133的表達(dá)情況；

2、利用RT-PCR檢測(cè)不同濃度吉西他濱處理后對(duì)干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的mRNA水平表達(dá)影響；通過Western-Blot方法檢測(cè)不同濃度吉西他濱處理后對(duì)上述干性分子的蛋白水平表達(dá)的變化；進(jìn)一步通過干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)吉西他濱處理后對(duì)胰腺癌細(xì)胞系的成球能力的影響；然后再利用吉西他濱（10μM）處理胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC-324h，通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)遷移能力的影響；通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處理后對(duì)吉西他濱

3、及5-氟尿嘧啶的藥物敏感性改變。
　　結(jié)果：不同濃度吉西他濱（0-1000μM）處理胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC-324h后，隨著濃度增加，對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷能力也增加，但在較低濃度范圍內(nèi)（0-10μM）對(duì)SW1990、BxPC-3的殺傷能力較小。1-10μM吉西他濱處理SW1990、BxPC-3細(xì)胞系24h后，干細(xì)胞表面標(biāo)記CD24+和CD133+的細(xì)胞數(shù)隨著濃度增加而增加；而且干性分子Bmi1、Nanog和Sox2在mR

4、NA和蛋白水平的表達(dá)也隨著吉西他濱處理濃度的增加而增加。吉西他濱（10μM）處理SW1990、BxPC-324h后，細(xì)胞的成球能力和遷移能力增強(qiáng)；同時(shí)也提高對(duì)化療藥吉西他濱及5-氟尿嘧啶的耐藥能力。
　　結(jié)論：低劑量的吉西他濱處理可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系的干細(xì)胞標(biāo)志分子CD24、CD133以及干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的表達(dá)，同時(shí)也增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞系的成球、遷移能力和化療耐藥性。
　　第二部分:STAT3的活化介導(dǎo)吉西

5、他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的干性增強(qiáng)
　　目的：研究吉西他濱處理對(duì)STAT3活化的影響，并探討STAT3的活化對(duì)吉西他濱促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞干性、遷移、耐藥和體內(nèi)成瘤能力所起的作用
　　方法：不同濃度吉西他濱（1-10μM）處理24h，利用Western-Blot方法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC-3的STAT3的活化情況；通過S3I-201預(yù)處理來抑制STAT3活性，然后再聯(lián)合吉西他濱處理，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD2

6、4及CD133的表達(dá)情況；通過RT-PCR檢測(cè)干性分子Bmi1、Nanog和Sox2在mRNA水平的表達(dá)變化；并利用Western-Blot檢測(cè)上述分子在蛋白水平的表達(dá)變化；通過干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)聯(lián)合吉西他濱和S3I-201對(duì)細(xì)胞成球能力的改變；然后利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)遷移能力的影響；以及通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處理后對(duì)吉西他濱及5-氟尿嘧啶的藥物敏感性變化。通過轉(zhuǎn)染STAT3siRNA，然后再聯(lián)合吉西他濱處理，利用RT-PC

7、R及Western-Blot檢測(cè)沉默STAT3對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)的干性分子Bmi1、Nanog和Sox2表達(dá)的影響。吉西他濱（10μM）處理SW1990細(xì)胞系后，利用p-STAT3進(jìn)行免疫共沉淀，通過ChIP的方法檢測(cè)其與干性分子Bmi1、Nanog和Sox2啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。再通過裸鼠皮下成瘤，聯(lián)合吉西他濱（20mg/kg，q.3d.）以及S3I-201（5mg/kg，q.2d.）腹腔注射，觀察對(duì)裸鼠成瘤大小及吉西他濱停藥后腫瘤復(fù)發(fā)的影響

8、。
　　結(jié)果：吉西他濱可以劑量依賴型的促進(jìn)p-STAT3（Y705）的表達(dá)，利用S3I-201抑制STAT3后，可以減少吉西他濱誘導(dǎo)的干細(xì)胞標(biāo)記分子CD24及CD133和干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的表達(dá)，而且S3I-201可以抑制吉西他濱所促進(jìn)的成球、遷移能力以及對(duì)吉西他濱、5-氟尿嘧啶耐藥性的增強(qiáng)。沉默STAT3可以顯著抑制吉西他濱誘導(dǎo)的干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的表達(dá)，而吉西他濱處理則可以增加活化的ST

9、AT3結(jié)合到上述三個(gè)干性分子啟動(dòng)子上。此外，S3I-201體內(nèi)也可以加強(qiáng)吉西他濱的化療殺傷作用，并抑制腫瘤的復(fù)發(fā)。
　　結(jié)論：吉西他濱通過促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞STAT3的活化來介導(dǎo)腫瘤的干性增強(qiáng)，以及與之相關(guān)的遷移、耐藥、體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)。
　　第三部分:Nox/ROS/NF-κB途徑的激活介導(dǎo)吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的干性增強(qiáng)
　　目的：研究吉西他濱處理對(duì)ROS生成及NF-κB信號(hào)通路的影響，以及ROS和NF-κB途徑在吉西

10、他濱促進(jìn)STAT3的活化及干性增強(qiáng)過程中所起的作用，并探討ROS的Nox生成途徑在吉西他濱誘導(dǎo)干性過程中所起的作用。
　　方法：利用DCF-DA探針，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同吉西他濱處理對(duì)ROS生成的影響；用ROS清除劑（NAC）預(yù)處理抑制ROS的生成，然后聯(lián)合吉西他濱處理，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD24及CD133的表達(dá)情況；通過Western-Blot檢測(cè)p-STAT3、STAT3及干性分子Bmi1、Nanog和Sox

11、2的表達(dá)變化；用干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)觀察NAC對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)成球能力的影響。吉西他濱（10μM）處理SW1990及BxPC-3細(xì)胞系后，通過RT-PCR檢測(cè)不同Noxs的表達(dá)水平。然后利用Nox抑制劑（Apocynin）預(yù)處理，分別利用上述方法檢測(cè)CD24、CD133以及p-STAT3、STAT3、Bmi1、Nanog、Sox2的表達(dá)變化，同時(shí)利用成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)Apocynin對(duì)成球能力的影響。然后通過核漿分離方法，利用Western-Blot

12、分別檢測(cè)吉西他濱及聯(lián)合NAC對(duì)核蛋白和漿蛋白中p65含量的表達(dá)影響；用NF-κB途徑的抑制劑（BYA11-7082）預(yù)處理，再聯(lián)合吉西他濱處理，分別通過流式細(xì)胞術(shù)、Western-Blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD24及CD133以及p-STAT3、STAT3、Bmi1、Nanog和Sox2的表達(dá)情況；再利用干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)觀察BYA11-7082對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)成球能力的影響。
　　結(jié)果：吉西他濱可以促進(jìn)ROS及Noxs（Nox1,No

13、x2,Nox4,Nox5及Duox1）的生成；抑制ROS或Noxs可以減少吉西他濱誘導(dǎo)的CD24、CD133以及p-STAT3、Bmi1、Nanog和Sox2的表達(dá)，同時(shí)也可以抑制吉西他濱所誘導(dǎo)成球能力增強(qiáng)。吉西他濱處理可以增加胰腺癌細(xì)胞核蛋白p65的表達(dá)，同時(shí)減少漿蛋白中p65的表達(dá)，而聯(lián)合NAC可以抑制上述效應(yīng)；用BYA11-7082抑制NF-κB的活化后，吉西他濱誘導(dǎo)的CD24、CD133以及p-STAT3、Bmi1、Nanog和