地西他濱對多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266增殖凋亡的影響及誘導P16基因去甲基化的實驗研究.pdf

1、目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一種的漿細胞克隆增殖性疾病。目前尚不能治愈，近些年MM的靶向藥物的研究取得了新的進展，去甲基化藥物地西他濱(decitabine，DAC)為其中一種。
　　 國內外研究均已證實一些MM細胞系中存在異常的高度甲基化，經常發(fā)生于富于CpG島的腫瘤抑制基因（如P15INK4B基因，P16基因，P53基因）啟動子區(qū)，并導致基因的沉默。DAC是一種核苷類似物，能夠在DNA復制過程

2、中摻入DNA，代替腫瘤內的胞嘧啶與DNA甲基化轉移酶共價結合，通過與DNMT半胱氨酸殘基上的巰基共價結合從而使酶失活。FDA已經正式批準DAC用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)?；A研究表明P16基因的缺失和突變在人類惡性腫瘤中普遍存在，并有報道在檢測各種惡性腫瘤細胞系中P16的突變率達30％～80％，P16基因甲基化在多發(fā)性骨髓瘤中較為常見。為進一步明確DAC對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖抑制及促凋亡的機制，本實驗選用多發(fā)性骨髓瘤細胞株U2

3、66，觀察DAC對U266細胞增殖的抑制以及誘導凋亡作用，檢測甲基化酶DNMT3AmRNA，P16基因mRNA表達的變化及DAC作用后P16基因甲基化狀態(tài)改變的情況。為多發(fā)性骨髓瘤新的治療方法提供理論依據。
　　 方法:
　　 1、常規(guī)方法培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266，每48-72小時傳代一次。選用對數期細胞進行試驗。每組實驗重復3次。
　　 2、CCK-8法檢測不同濃度的DAC單藥對多發(fā)性骨髓瘤細胞U266

4、增殖的影響:DAC的終濃度分別為0.2、0.5、1.2mmol/L，單藥組分別作用24h、48h、72h觀察U266細胞的抑制率。計算公式為:細胞增殖抑制率(％）=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100％。
　　 3、AnnexinV/PI雙染法檢測不同濃度的DAC對U266細胞凋亡的影響，藥物作用濃度同方法2，觀察單藥作用24h、48h、72h的凋亡率。
　　 4、流式細胞儀檢測不同濃度DAC作用72小時后細胞周期

5、分布變化。70％乙醇透膜處理細胞。后加入RNase孵育，加入PI(Propidiumidodide染色劑)染液室溫避光染色30min。藥物濃度同方法2。
　　 5、實時熒光定量PCR法(real-timeQ-PCR)檢測P16基因mRNA，DNMT3AmRNA的表達情況。收集終濃度為0.2、0.5、1.2mmol/L的DAC分別作用48h后的細胞，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA后，real-time-PCR法檢測P16基因mR

6、NA，DNMT3AmRNA的表達。記錄各組目的基因及內參基因CT值，應用公式F=2-△△CT計算，△△CT值=（待測組目的基因CT值-待測組內參基因CT值）-（對照組目的基因CT值-對照組內參基因CT值），得相對表達量。DNMT3A、P16基因及內對照基因引物序列:DNMT3A上游引物:5;-TATTGATGAGCGCACAAGAGAGC-3';下游引物:5'-GGGTGTTCCAGGGTAACATTGAC-3';片段長度:113bp。

7、P16上游引物:5'-CGGAAGGTCCCTCAGACATC-3';下游引物:5'-TCATGAAGTCGACAGCTTCCG-3';片段長度:385bp。β-actin上游引物:5'-GTGACATTAAGGAGAAGCTG-3';下游引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3';片段長度:510bp。
　　 6、甲基化特異性PCR法(MSP法)檢測DAC濃度作用48小時前后P16基因的甲基化狀態(tài)。藥物濃度同

8、方法2。MSP法檢測三種不同濃度的DAC作用于U266細胞48h后甲基化狀態(tài)，設不加藥的空白對照組。MSP法過程:經過亞硫酸氫鹽處理DNA，DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。設計針對甲基化及非甲基化位點的引物各一對，PCR擴增。若甲基化引物能擴增出片段，說明該檢測位點存在甲基化，若非甲基化引物擴增出片段，說明存在非甲基化。此方法為定性分析法。
　　 7、統(tǒng)計學分析:SPSS13.0軟件進行分析，先做

9、正態(tài)性分布檢測，分組資料的表示用均數±標準差。做方差齊性檢測，方差齊同，兩組比較應用t檢驗，多組比較應用單因素方差分析;方差不齊，應用非參數檢驗。P＜0.05為有差異，提示有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、DAC對U266細胞增殖抑制的影響
　　 不同終濃度(0.2mmol/L，0.5mmol/L，1.2mmol/L)的DAC作用于U266細胞24h、48h、72h后，分別以時間，劑量為變量，進行單因素方差

10、分析。發(fā)現隨著藥物作用濃度的增加和作用時間的延長，增殖抑制率有明顯增高趨勢。24h后分別為:5.30±1.08(％)，7.50±0.44(％)，22.33士2.18(％）;48h后分別為:11.17±4.75(％)，20.17±5.16(％)，30.40±2.26(％);72h后:25.80±6.52(％)，43.70±6.71(％)，59.33±2.30(％)。各處理組之間進行統(tǒng)計學分析，除低濃度24h和48h組比較P=0.101外，

11、各組間比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。DAC抑制U266細胞增殖，并呈時間，劑量依賴性。
　　 2、DAC對U266細胞凋亡的影響
　　 AnnexinV/PI雙染法檢測結果顯示，不同濃度相同時間下細胞凋亡率逐漸增加，提示DAC誘導U266細胞凋亡呈濃度依賴性。24h、48h、72h不同時間相同濃度下，細胞凋亡率逐漸增加，提示呈時間依賴性。對照組、0.2、0.5、1.2mmol/LDAC組作用24h后:8.23±0.

12、70(％)、13.30±0.75(％)、17.38±0.63(％)、27.58±1.32(％);48h后:11.33±1.02(％)、16.75±1.84(％)、25.78±6.27(％)、37.53±1.36(％);72h后:19.25±1.20(％)、27.70±1.85(％)、35.23±3.74(％)、49.18±5.70(％)。隨時間延長和藥物濃度的增加，統(tǒng)計分析藥物組和對照組之間，藥物組之間均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。顯

13、示DAC可誘導U266細胞凋亡，并呈時間和劑量依賴。實驗結果還發(fā)現DAC誘導U266細胞凋亡以早期凋亡為主，凋亡率分別是:24h:5.90±0.93(％)、7.43±0.42(％)、11.93±4.02(％)、16.68±4.51(％);48h:6.93±0.53(％)、11.15±1.72(％)、19.98±7.11(％)、30.40±2.36(％);72h:16.70±0.85(％)、19.68±2.84(％)、30.95±5.29

14、(％)、42.75±6.19(％)。并呈時間和劑量依賴。
　　 3、DAC對U266細胞周期的影響
　　 PI染色流式細胞術分析結果顯示，DAC作用于U266細胞72小時后，G0/G1期細胞逐漸增多，S期及G2/M期細胞均減少。隨濃度增加對照組、0.2、0.5、1.2mmol/L藥物組G0/G1期細胞分別為:82.01±1.68(％)、89.21±1.22(％)、92.86±1.13(％)、96.75±0.48(％)，統(tǒng)

15、計分析各處理組與對照組，各個處理組間，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。S期細胞分別為:2.32±0.57(％)、1.19±0.28(％)、0.92±0.37(％)、1.08±0.71(％);非參統(tǒng)計分析P=0.075，無統(tǒng)計學意義。本試驗結果顯示應用DAC可減少S期細胞，但并沒有濃度依賴性，G2/M期細胞分別為:13.87±2.28(％)、9.12±1.52(％)、5.80±0.47(％)、2.02±0.84(％)。統(tǒng)計分析各處理組與對

16、照組，各個處理組間，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。提示DAC阻滯U266細胞于G0/G1期，并隨劑量增加而作用增強。
　　 4、DAC對U266細胞DNMT3AmRNA、P16基因表達量的影響
　　 Q-PCR結果顯示，0.2、0.5、1.2mmol/L三種不同濃度的DAC作用于U266細胞48h同對照組相比，DNMT3AmRNA平均表達水平隨藥物濃度逐漸降低。設對照組為1，目的基因相對表達量分別為0.77±0.13、

17、0.42±0.11、0.24±0.18倍，0.5、1.2mmol/L組比較P=0.204，無明顯差別，其余各組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05）。P16mRNA平均表達水平隨藥物濃度逐漸增高，相對表達量分別為1.67±0.34、2.48±0.37、3.23±0.30倍，各組間比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05）。
　　 5、DAC對U266細胞株P16基因甲基化的影響
　　 MSP法檢測發(fā)現U266細胞株中存在P16基因啟動

18、子區(qū)高甲基化，經過DAC處理后，出現甲基化及非甲基化條帶，呈現部分甲基化狀態(tài)。且隨著濃度增加，甲基化條帶亮度降低，非甲基化條帶亮度逐漸增加。提示DAC可部分逆轉U266細胞株P16基因甲基化。
　　 結論:
　　 1、DAC抑制U266細胞增殖，并促進U266細胞凋亡，以早期凋亡為主，呈時間和劑量依賴性。
　　 2、DAC能使U266細胞周期阻滯于G0/G1期，進而阻滯細胞的增殖，呈劑量依賴性。
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