尿毒癥環(huán)境血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制及左旋肉毒堿的保護(hù)作用.pdf

1、研究目的：終末期腎病尤其血液透析患者心血管并發(fā)癥發(fā)病率和死亡率遠(yuǎn)高于普通人群，大量研究證實(shí)，此類患者普遍存在的炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能紊亂是導(dǎo)致加速發(fā)展的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病的主要原因。目前研究主要針對(duì)特定尿毒癥毒素造成組織細(xì)胞損傷的機(jī)制，尿毒癥環(huán)境對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的損傷情況尚不明確。左旋肉毒堿在血透患者應(yīng)用較廣泛，研究證實(shí)它有抗氧化作用，因此對(duì)尿毒癥環(huán)境引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用終末期腎病血液透析患

2、者血清在體外構(gòu)建尿毒癥環(huán)境，觀察尿毒癥環(huán)境誘導(dǎo)的HUVEC形態(tài)、活力、一氧化氮釋放、丙二醛含量、活性氧、白介素-6變化及左旋肉毒堿干預(yù)對(duì)它們的影響。探討尿毒癥環(huán)境引起的HUVEC功能障礙機(jī)制及左旋肉毒堿的保護(hù)作用。 研究方法： 1.體外尿毒癥環(huán)境的構(gòu)建：選取病情穩(wěn)定，透析充分，無(wú)感染、損傷、嚴(yán)重并發(fā)癥、近兩周未使用鐵劑及抗氧化劑的血液透析患者15例，隨機(jī)每3例為一組混合血清為5組，用0.22μ的濾膜過(guò)濾除菌后配制成各濃度

3、M199尿毒癥血清培養(yǎng)液。以同期體檢中心健康人血清構(gòu)建健康人內(nèi)環(huán)境。兩組性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2. 細(xì)胞培養(yǎng)與分組以體外培養(yǎng)的HUVEC為研究對(duì)象。 （1）觀察尿毒癥環(huán)境對(duì)HUVEC的損傷機(jī)制：將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（N組：含1％ 超級(jí)新生牛血清）、尿毒癥組（U組：分別含2.5％、5％、10％、15％的血透患者血清）、健康對(duì)照組（H組：分別含2.5％、5％、10％、15％的健康人血清）。 （2）觀察左旋肉毒堿對(duì)

4、HUVEC功能障礙和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用：將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（N組：含1％ 超級(jí)新生牛血清）、尿毒癥組（U組：含5％血透患者血清）、左旋肉毒堿干預(yù)組（LC組：分別含不同濃度L-CN：25μM, 250μM, 1000μM, 2500μM）。 3. 方法： （1）相差顯微鏡下觀察HUVEC形態(tài)改變。 （2）MTT法測(cè)細(xì)胞活力。 （3）比色法檢測(cè)細(xì)胞上清液一氧化氮含量及胞漿丙二醛含量。 （4）以2、7

5、-二氫二氯熒光素染色(DCFH)和熒光分光光度計(jì)法檢測(cè)ROS強(qiáng)度。 （5）RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)IL-6表達(dá)。 研究結(jié)果： 1. 相差顯微鏡下，尿毒癥環(huán)境內(nèi)的HUVEC細(xì)胞出現(xiàn)損傷性表現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)分泌物增多，細(xì)胞間隙增寬，高濃度尿毒癥環(huán)境可引起細(xì)胞脫落壞死。 2. MTT結(jié)果顯示：各濃度組尿毒癥環(huán)境中HUVEC活力明顯低于同濃度健康人；相對(duì)于同濃度健康人尿毒癥環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)抑制率呈濃度依賴

6、性增加；高濃度（2500μM）左旋肉毒堿干預(yù)后可改善細(xì)胞活力。 3. 5％～10％尿毒癥環(huán)境中HUVEC細(xì)胞上清液NO含量呈濃度依賴性下降，胞漿MDA呈濃度依賴性上升；與健康人對(duì)比NO的減少及MDA的增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；左旋肉毒堿（250μM～2500μM）干預(yù)可緩解尿毒癥環(huán)境引起的NO和MDA改變。 4. 尿毒癥環(huán)境能使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及IL-6表達(dá)濃度依賴性增加；且與健康人對(duì)照差異顯著；而L-CN（250μM～250