內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在尿毒癥血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷中的作用.pdf

1、背景：
　　 心血管疾病(CVD)是終末期腎病(ESRD)患者常見(jiàn)的并發(fā)癥和最主要的死亡原因。
　　 已經(jīng)證實(shí)尿毒癥加速性動(dòng)脈粥樣硬化是最危險(xiǎn)的因素。與普通人群相比，尿毒癥并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化具有發(fā)病年齡早、發(fā)病率高、病變累積廣泛等特點(diǎn)。傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素如：
　　 高血壓、糖尿病、血脂代謝紊亂等雖在慢性腎衰病人中也較為普遍，但并不能滿意解釋尿毒癥患者如此高的加速性動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率和死亡率，因此推測(cè)，尿毒癥患者存在某些

2、特殊致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)因子?，F(xiàn)已明確AS 實(shí)質(zhì)是血管壁細(xì)胞的慢性增殖性炎癥反應(yīng)，即致AS 危險(xiǎn)因子首先導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴的舒張功能下降，炎癥信號(hào)激活和表達(dá)炎癥細(xì)胞因子等。
　　 ERSD患者體內(nèi)嚴(yán)重的代謝紊亂，存在多種毒素，如氧化應(yīng)激產(chǎn)物、各種終末糖基化產(chǎn)物和各種炎癥介質(zhì)等，它們與內(nèi)皮細(xì)胞相接觸，可通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)還可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎癥因子、生長(zhǎng)因子、粘附分子，誘發(fā)持續(xù)的

3、微炎癥狀態(tài)。同時(shí)，這些活化細(xì)胞因子又可以介導(dǎo)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步釋放多種炎癥因子，從而發(fā)揮正反饋效應(yīng)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加劇。如此的惡性循環(huán)必然導(dǎo)致AS的發(fā)生。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)作為細(xì)胞漿信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的整合器，可以通過(guò)與氧化應(yīng)激、泛素-蛋白酶體途徑(UPP)以及炎癥反應(yīng)等信號(hào)途徑相偶聯(lián)，參與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、癌癥等的發(fā)生與發(fā)展。從理論上講，通過(guò)調(diào)控ERS 這一炎癥反應(yīng)的中樞環(huán)節(jié)的激活對(duì)于防治細(xì)胞功能損

4、傷有著重要的臨床意義。但是，ERS是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，在維持機(jī)體的防御功能和細(xì)胞死亡平衡方面有著重要的作用，完全阻斷又會(huì)導(dǎo)致免疫功能缺陷。因此適度的調(diào)控ERS，并且有針對(duì)性的特異性阻斷，可能成為控制尿毒癥加速性動(dòng)脈粥樣硬化新思路。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中非常重要的蛋白，具有促進(jìn)和監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一些重要功能，如新生多肽鏈的易位、分泌蛋白的折疊和組裝、監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)作、識(shí)別未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白以及定位那些

5、待降解的蛋白以穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，促進(jìn)蛋白折疊，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，它的這些特點(diǎn)為我們調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞ERS的活化，減輕組織細(xì)胞損傷提供了理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 本課題通過(guò)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)與尿毒癥血清共培養(yǎng)模擬ERSD內(nèi)環(huán)境來(lái)觀察經(jīng)尿毒癥血清孵育后細(xì)胞增殖能力、ERS 活性以及炎癥細(xì)胞因子的變化規(guī)律，探討ERS信號(hào)通路的活化在尿毒癥血清致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活中的作用，并分析通過(guò)小分子伴侶4-苯基丁酸(4

6、-PBA)干預(yù)ERS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥增殖反應(yīng)的影響，為臨床有效防治尿毒癥加速性動(dòng)脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.將細(xì)胞分為正常血清組(H)、尿毒癥血清組(U)以及4-PBA 干預(yù)組(4-PBA)，分別用不同濃度的尿毒癥患者血清(2.5％、5％、10％、15％、20％)或正常血清(2.5％、5％、10％、15％、20％)或含有5mM的4-PBA 刺激。
　　 2.應(yīng)用HE 染色觀察HUVECs的

7、形態(tài)。
　　 3.應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　 4.Hoechst 33342 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 5.應(yīng)用熒光定量PCR 方法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞分泌GRP78、MCP-1、NF-κ B、P 21、VEGF的mRNA表達(dá)水平。
　　 6.應(yīng)用ELISA 方法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞上清液中MCP-1、VEGF的濃度。
　　 7.Western blot 檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞GRP78、MC

8、P-1、NF-κ B、P 21蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.尿毒癥血清對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響與同濃度的正常血清組相比，2.5％～10％的尿毒癥血清能使細(xì)胞吸光度和S 期細(xì)胞的比例呈濃度依賴性顯著上升，細(xì)胞P 21mRNA的表達(dá)降低(均P<0.05)；隨著濃度的繼續(xù)增加，吸光度和S 期細(xì)胞的比例逐漸下降，而P 21的表達(dá)則轉(zhuǎn)向升高，熒光染色發(fā)現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，提示尿毒癥血清在低濃度時(shí)(≤10％)呈濃度依賴性促進(jìn)血管

9、內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但是較高濃度(>10％)時(shí)促增殖作用減弱，伴隨促凋亡作用增強(qiáng)。
　　 2.尿毒癥血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用與正常血清組相比，2.5％、5％、10％的尿毒癥血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h，GRP78的表達(dá)顯著增加，且隨濃度的增加有進(jìn)行性升高的趨勢(shì)，提示ERS在尿毒癥血清誘導(dǎo)的HUVECs中顯著激活，且其強(qiáng)度隨著尿毒癥血清濃度的增加進(jìn)行性增強(qiáng)。
　　 3.尿毒癥血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號(hào)激活和炎癥因子表達(dá)的影響(1)正

10、常血清組：與無(wú)血清組相比，10％正常血清刺激HUVECs后可以檢測(cè)出少量的NF-κ B、VEGF和MCP-1，兩者相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)尿毒癥血清組：與正常血清組相比，10％尿毒癥血清能使內(nèi)皮細(xì)胞NF-κ B、VEGF和MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)，提示尿毒癥血清引起了血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號(hào)的激活，炎癥因子表達(dá)上調(diào)。
　　 4.分子伴侶抑制尿毒癥血清刺激細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(1)尿毒癥血

11、清組：與正常血清組相比較，尿毒癥血清刺激2h、6h、12h 均能使內(nèi)皮細(xì)胞GRP78 mRNA的表達(dá)上調(diào)，GRP78蛋白的表達(dá)增加(均P<0.05)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性升高趨勢(shì)。
　　 (2)4-PBA 干預(yù)組:與尿毒癥血清組相比較，4-PBA 治療6h后GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下降(P<0.05)，治療12h后進(jìn)一步降低，與正常血清組相比已無(wú)明顯差別，提示4-PBA能有效地減輕尿毒癥血清引起的ERS。
　

12、　 5.分子伴侶抑制尿毒癥血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號(hào)激活及炎癥因子的表達(dá)(1)尿毒癥血清組：與正常血清組相比較，在第2、6、12h 末，尿毒癥血清組NF-κ B、MCP-1和VEGF的表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性升高趨勢(shì)。
　　 (2)4-PBA 干預(yù)組:與尿毒癥血清組相比較，4-PBA 治療2h NF-κ B、MCP-1和VEGF的表達(dá)無(wú)明顯差異，但是作用6h能顯著降低NF-κ B、MCP-1和V

13、EGF的表達(dá)(均P<0.05)，治療12h后進(jìn)一步降低，這些結(jié)果提示4-PBA能有效地減輕尿毒癥血清引起的炎癥信號(hào)的激活和炎癥因子的表達(dá)。
　　 6.分子伴侶抑制尿毒癥血清刺激的細(xì)胞增殖(1)尿毒癥血清組：與正常血清組相比較，尿毒癥血清刺激2h、6h、12h后細(xì)胞吸光度和S 期細(xì)胞的比例顯著增加(均P<0.05)，且隨著時(shí)間的進(jìn)展進(jìn)一步升高；而細(xì)胞P 21mRNA表達(dá)卻顯著降低(P<0.05)。
　　 (2)4-PBA

14、干預(yù)組:與尿毒癥血清組相比較，4-PBA 治療6h和12h，吸光度和S 期細(xì)胞的比例升高幅度有了明顯的減弱，而P 21mRNA的表達(dá)下降的幅度也受到了顯著抑制(P<0.05)，表明4-PBA能有效地減輕尿毒癥血清引起的細(xì)胞異常增殖，恢復(fù)細(xì)胞活性的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1．ERS是介導(dǎo)尿毒癥血清損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要分子機(jī)制。
　　 2．分子伴侶4-PBA 可通過(guò)調(diào)控ERS 抑制尿毒癥血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能損