致癌基因FOXK1通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一章:FOXK1在結(jié)腸癌中的表達(dá)與臨床相關(guān)性的研究
　　目的:
　　本課題以組織芯片、免疫組化、Western、qRT-PCR、穩(wěn)定表達(dá)株構(gòu)建技術(shù)、雙熒光素酶基因報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)、生存分析等實(shí)驗(yàn)手段。對(duì)FOXK1的人體腫瘤組織（包括結(jié)直腸癌）中表達(dá)情況進(jìn)行具體檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)FOXK1在結(jié)直腸癌中癌基因的作用。圍繞FOXK1在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)弱及其與臨床特點(diǎn)、生存率的關(guān)系進(jìn)行探討，繼

2、而為結(jié)腸癌的基因治療提供幫助。
　　方法:
　　1、FOXK1在15類正常及腫瘤組織中的表達(dá)情況
　　2、FOXK1在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　3、過表達(dá)FOXK1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)癌基因表達(dá)的影響
　　4、FOXK1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床特點(diǎn)及預(yù)后的關(guān)系
　　5、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、qRT-PCR結(jié)果用三或兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P＞0.

3、05)則進(jìn)行兩個(gè)處理組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或多個(gè)處理組間one way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，整體比較有顯著性差異后多重比較采用LSD法;方差不齊(P＜0.05)則應(yīng)用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)或Welch檢驗(yàn)分析，整體比較有顯著性差異后多重比較采用Duunett's T3檢驗(yàn)。通過免疫組織化學(xué)的得分判斷FOXK1的表達(dá)高低與臨床病理（多個(gè)處理組）特點(diǎn)運(yùn)用兩樣本率比較采用四格表資料的x2檢驗(yàn)，多樣本率的比較采用行列表資料的x2檢驗(yàn)，

4、如果某一個(gè)分組的樣本特別小，相關(guān)性分析則采用Fisher's精確檢驗(yàn)，生存分析方法采用log-rank檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1、FOXK1在多數(shù)正常組織中不表達(dá)，在腫瘤組織中均表達(dá)增高
　　2、FOXK1在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中均呈高表達(dá)
　　2.1、FOXK1在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增高
　　2.2、FOXK1在7個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中均有表達(dá)
　　3、過表達(dá)FOXK1促進(jìn)腸癌細(xì)胞內(nèi)癌基因的啟動(dòng)子活性

5、及mRNA水平的表達(dá)
　　3.1、Western blotting及qRT-PCR證實(shí)成功構(gòu)建了pcDNA3.1-FOXK1-SW480及pcDNA3.1-SW480的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。
　　3.2、過表達(dá)FOXK1增加結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)癌基因mRNA水平的表達(dá)
　　3.3、過表達(dá)FOXK1后提高結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)Survivin，Cyclin D1和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性
　　4、FOXK1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者7年總體生存率

6、呈負(fù)相關(guān)
　　結(jié)論:
　　1.FOXK1在人體皮膚、睪丸、腎臟、卵巢、前列腺、肺、食管、胰腺、宮頸、大腦、胃、小腸、乳腺、結(jié)腸、直腸組織中扮演癌基因的角色;
　　2.過表達(dá)FOXK1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的致癌性;
　　3.FOXK1高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者AJCC分期、TNM分期、腫瘤大小、病理分化程度、是否淋巴結(jié)累及相關(guān);
　　4.FOXK1高表達(dá)是腸癌患者預(yù)后不良的因素之一
　　第二章:FOXK1在腸癌細(xì)

7、胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中EMT相關(guān)功能的研究
　　目的:
　　本課題將圍繞FOXK1在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中EMT相關(guān)機(jī)制展開研究。
　　方法:
　　1、評(píng)估FOXK1在結(jié)直腸原位癌及轉(zhuǎn)移癌的關(guān)系
　　2、低表達(dá)FOXK1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響
　　3、評(píng)估FOXK1表達(dá)的變化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的影響
　　4、闡明FOXK1是否可逆轉(zhuǎn)rTGF-β1引起的EMT影響:
　　4.1、評(píng)價(jià)

8、rTGF-β1對(duì)FOXK1、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　4.2、低表達(dá)FOXK1阻斷rTGF-β1對(duì)EMT的作用
　　5、壓低FOXK1表達(dá)對(duì)體內(nèi)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響
　　5.1、構(gòu)建低表達(dá)FOXK1的穩(wěn)定表達(dá)株
　　5.2、脾被膜下肝轉(zhuǎn)移模型的建立
　　結(jié)果:
　　1、FOXK1在原發(fā)結(jié)直腸癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中均高表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)OXK1在腫瘤細(xì)胞核及腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞中均呈高

9、表達(dá)，即高表達(dá)FOXK1的腸癌細(xì)胞可以突破基底膜，具有更強(qiáng)的侵襲能力。正常結(jié)腸腺體上皮細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。
　　2、低表達(dá)FOXK1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力
　　2.1、低表達(dá)FOXK1序列的驗(yàn)證
　　將FOXK1-siRNA及Scr-siRNA序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞后，Westernblotting證實(shí)轉(zhuǎn)染FOXK1-siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和SW1116均較對(duì)照組FOXK1的表達(dá)明顯壓低。
　

10、　2.2、低表達(dá)FOXK1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力
　　FOXK1-siRNA-SW480組腸癌細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至60小時(shí)的遷移比率為52.02±0.087％，對(duì)照組SW480細(xì)胞已完全匯合。
　　2.3、低表達(dá)FOXK1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力
　　壓低組FOXK1-siRNA-SW480與對(duì)照組Scr-siRNA-SW480相比，Transwell實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為48.5±4.93和72.5±6.14

11、，壓低組FOXK1-siRNA-SW1116與對(duì)照組Scr-siRNA-SW1116相比，細(xì)胞數(shù)分別為61.25±6.65和118.5±15.76，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、FOXK1表達(dá)水平與腸癌細(xì)胞EMT相關(guān)
　　3.1、過表達(dá)FOXK1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)的影響
　　穩(wěn)定表達(dá)株FOXK1-pcDNA3.1-SW480呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)如成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而對(duì)照細(xì)胞pcDNA3.1-SW480穩(wěn)定表達(dá)株呈現(xiàn)出短圓、平坦的細(xì)

12、胞形態(tài)。羅丹明結(jié)果顯示:過表達(dá)FOXK1的穩(wěn)定細(xì)胞邊緣地帶突出，伸出偽足。
　　3.2、FOXK1表達(dá)變化對(duì)EMT標(biāo)記物的影響
　　應(yīng)用間接免疫熒光方法對(duì)E-cadherin和Vimentin分別染色，熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞分布。綠色熒光偶聯(lián)Vimentin蛋白，紅色熒光偶聯(lián)E-cadherin，可以看出低表達(dá)FOXK1后，E-cadherin表達(dá)增加，且膜表達(dá)遞增，Vimentin表達(dá)降低，有胞膜胞漿高表達(dá)降低為胞膜胞漿低

13、表達(dá);穩(wěn)定表達(dá)株FOXK1-pcDNA3.1-SW480、 pcDNA3.1-SW480，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的FOXK1-siRNA-SW480、Scr-siRNA-SW480四組細(xì)胞進(jìn)行Western-blotting發(fā)現(xiàn)E-cadherin和γ-catenin的表達(dá)隨FOXK1升高而降低，隨FOXK1的表達(dá)降低而升高。
　　4、壓低FOXK1可逆轉(zhuǎn)rTGF-β1引起的EMT影響
　　4.1、rTGF-β1以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)FOX

14、K1和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　rTGF-β1作用后0H、24H、48H觀察，SW480和SW1116細(xì)胞中FOXK1表達(dá)量隨作用時(shí)間的增加而遞增，同時(shí)EMT相關(guān)蛋白的間質(zhì)標(biāo)識(shí)蛋白vimentin的表達(dá)亦出現(xiàn)遞增，E-cadherin則隨著rTGF-β1作用時(shí)間的增加而表達(dá)降低。
　　4.2、低表達(dá)FOXK1阻斷rTGF-β1對(duì)FOXK1及EMT的誘導(dǎo)作用
　　對(duì)照組的SW1116細(xì)胞和SW480細(xì)胞在加入rTGF-β

15、1后細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，并伸出觸角、偽足，而E-cadherin表達(dá)降低、Vimentin表達(dá)增加;Transwell試驗(yàn)中穿過基底膜的細(xì)胞也增加;但是通過轉(zhuǎn)染FOXK1-siRNA后，纖長(zhǎng)有觸角、偽足的腸癌細(xì)胞再次變得短圓，而E-cadherin表達(dá)升高，vimentin的表達(dá)降低，侵襲試驗(yàn)中穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)亦大大減少。以上數(shù)據(jù)均表明低表達(dá)FOXK1阻斷rTGF-β1對(duì)FOXK1及EMT的誘導(dǎo)作用。
　　5、壓低FOXK1表達(dá)對(duì)體內(nèi)

16、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響
　　5.1、慢病毒FOXK1-shRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后FOXK1表達(dá)降低
　　Western blotting顯示轉(zhuǎn)染慢病毒FOXK1-shRNA的SW480細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組，F(xiàn)OXK1表達(dá)量明顯下降。綠色熒光顯示:在96小時(shí)，熒光強(qiáng)度和范圍達(dá)到95％以上。
　　5.2、FOXK1可誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移及EMT過程
　　SW480/pEGFP-FOXK1和 SW480/pEGFP-N

17、1(Vector)，或SW480/pEGFP-FOXK1 shRNA和SW480/pEGFP-src shRNA相比較，F(xiàn)OXK1高表達(dá)組的SW480引起的腫瘤更大。HE染色證實(shí)肝組織中存在轉(zhuǎn)移的腸癌腺體細(xì)胞。免疫組織化學(xué)明確正常肝細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)較FOXK1高表達(dá)細(xì)胞所引起的肝臟轉(zhuǎn)移癌組織的更高，qRT-PCR驗(yàn)證得到SW480/pEGFP-N1(Vector)較SW480/pEGFP-FOXK1組E-cadherin

18、表達(dá)高，說明低表達(dá)FOXK1可以抑制腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，高表達(dá)FOXK1可以促進(jìn)長(zhǎng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，并且高表達(dá)FOXK1可促進(jìn)轉(zhuǎn)移癌中的EMT過程。
　　結(jié)論:
　　1、FOXK1在原發(fā)結(jié)直腸癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)
　　2、低表達(dá)FOXK1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT、遷移、侵襲
　　3、低表達(dá)FOXK1可逆轉(zhuǎn)rTGF-β1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT、侵襲作用
　　4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)低表達(dá)FOXK1可抑制結(jié)直