致癌基因FOXK1通過誘導EMT促進結直腸癌細胞的侵襲轉移.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一章:FOXK1在結腸癌中的表達與臨床相關性的研究
　　目的:
　　本課題以組織芯片、免疫組化、Western、qRT-PCR、穩(wěn)定表達株構建技術、雙熒光素酶基因報告檢測系統(tǒng)、生存分析等實驗手段。對FOXK1的人體腫瘤組織（包括結直腸癌）中表達情況進行具體檢測，進一步證實FOXK1在結直腸癌中癌基因的作用。圍繞FOXK1在結腸腫瘤中的表達強弱及其與臨床特點、生存率的關系進行探討，繼

2、而為結腸癌的基因治療提供幫助。
　　方法:
　　1、FOXK1在15類正常及腫瘤組織中的表達情況
　　2、FOXK1在結直腸癌組織及細胞中的表達情況
　　3、過表達FOXK1對結直腸癌細胞內癌基因表達的影響
　　4、FOXK1在結直腸癌組織中的表達與臨床特點及預后的關系
　　5、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理
　　雙熒光素酶報告基因檢測、qRT-PCR結果用三或兩次實驗結果先進行方差齊性檢驗，方差齊(P＞0.

3、05)則進行兩個處理組間獨立樣本t檢驗或多個處理組間one way ANOVA統(tǒng)計分析，整體比較有顯著性差異后多重比較采用LSD法;方差不齊(P＜0.05)則應用Satterthwaite近似t檢驗或Welch檢驗分析，整體比較有顯著性差異后多重比較采用Duunett's T3檢驗。通過免疫組織化學的得分判斷FOXK1的表達高低與臨床病理（多個處理組）特點運用兩樣本率比較采用四格表資料的x2檢驗，多樣本率的比較采用行列表資料的x2檢驗，

4、如果某一個分組的樣本特別小，相關性分析則采用Fisher's精確檢驗，生存分析方法采用log-rank檢驗。
　　結果:
　　1、FOXK1在多數(shù)正常組織中不表達，在腫瘤組織中均表達增高
　　2、FOXK1在結直腸癌組織及細胞中均呈高表達
　　2.1、FOXK1在原發(fā)性結直腸癌組織中表達增高
　　2.2、FOXK1在7個結直腸癌細胞系中均有表達
　　3、過表達FOXK1促進腸癌細胞內癌基因的啟動子活性

5、及mRNA水平的表達
　　3.1、Western blotting及qRT-PCR證實成功構建了pcDNA3.1-FOXK1-SW480及pcDNA3.1-SW480的穩(wěn)定表達細胞株。
　　3.2、過表達FOXK1增加結直腸癌細胞內癌基因mRNA水平的表達
　　3.3、過表達FOXK1后提高結直腸癌細胞內Survivin，Cyclin D1和AP-1的轉錄活性
　　4、FOXK1的表達與結直腸癌患者7年總體生存率

6、呈負相關
　　結論:
　　1.FOXK1在人體皮膚、睪丸、腎臟、卵巢、前列腺、肺、食管、胰腺、宮頸、大腦、胃、小腸、乳腺、結腸、直腸組織中扮演癌基因的角色;
　　2.過表達FOXK1促進結直腸癌細胞的致癌性;
　　3.FOXK1高表達與結直腸癌患者AJCC分期、TNM分期、腫瘤大小、病理分化程度、是否淋巴結累及相關;
　　4.FOXK1高表達是腸癌患者預后不良的因素之一
　　第二章:FOXK1在腸癌細

7、胞侵襲、轉移過程中EMT相關功能的研究
　　目的:
　　本課題將圍繞FOXK1在結腸癌細胞侵襲、轉移過程中EMT相關機制展開研究。
　　方法:
　　1、評估FOXK1在結直腸原位癌及轉移癌的關系
　　2、低表達FOXK1對結腸癌細胞遷移、侵襲的影響
　　3、評估FOXK1表達的變化對結直腸癌細胞EMT的影響
　　4、闡明FOXK1是否可逆轉rTGF-β1引起的EMT影響:
　　4.1、評價

8、rTGF-β1對FOXK1、EMT相關蛋白表達的影響
　　4.2、低表達FOXK1阻斷rTGF-β1對EMT的作用
　　5、壓低FOXK1表達對體內腫瘤侵襲轉移作用的影響
　　5.1、構建低表達FOXK1的穩(wěn)定表達株
　　5.2、脾被膜下肝轉移模型的建立
　　結果:
　　1、FOXK1在原發(fā)結直腸癌及淋巴結轉移癌中均高表達
　　免疫組化結果證實，F(xiàn)OXK1在腫瘤細胞核及腫瘤相關的基質細胞中均呈高

9、表達，即高表達FOXK1的腸癌細胞可以突破基底膜，具有更強的侵襲能力。正常結腸腺體上皮細胞未發(fā)現(xiàn)陽性表達。
　　2、低表達FOXK1抑制結直腸癌細胞遷移、侵襲能力
　　2.1、低表達FOXK1序列的驗證
　　將FOXK1-siRNA及Scr-siRNA序列瞬時轉染結腸癌細胞后，Westernblotting證實轉染FOXK1-siRNA的結直腸癌細胞SW480和SW1116均較對照組FOXK1的表達明顯壓低。
　

10、　2.2、低表達FOXK1抑制結腸癌細胞遷移能力
　　FOXK1-siRNA-SW480組腸癌細胞在劃痕實驗進行至60小時的遷移比率為52.02±0.087％，對照組SW480細胞已完全匯合。
　　2.3、低表達FOXK1抑制結腸癌細胞侵襲能力
　　壓低組FOXK1-siRNA-SW480與對照組Scr-siRNA-SW480相比，Transwell實驗計數(shù)穿過基底膜的細胞數(shù)分別為48.5±4.93和72.5±6.14

11、，壓低組FOXK1-siRNA-SW1116與對照組Scr-siRNA-SW1116相比，細胞數(shù)分別為61.25±6.65和118.5±15.76，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3、FOXK1表達水平與腸癌細胞EMT相關
　　3.1、過表達FOXK1對結腸癌細胞形態(tài)的影響
　　穩(wěn)定表達株FOXK1-pcDNA3.1-SW480呈現(xiàn)出細長如成纖維細胞的形態(tài)，而對照細胞pcDNA3.1-SW480穩(wěn)定表達株呈現(xiàn)出短圓、平坦的細

12、胞形態(tài)。羅丹明結果顯示:過表達FOXK1的穩(wěn)定細胞邊緣地帶突出，伸出偽足。
　　3.2、FOXK1表達變化對EMT標記物的影響
　　應用間接免疫熒光方法對E-cadherin和Vimentin分別染色，熒光顯微鏡下觀察其細胞分布。綠色熒光偶聯(lián)Vimentin蛋白，紅色熒光偶聯(lián)E-cadherin，可以看出低表達FOXK1后，E-cadherin表達增加，且膜表達遞增，Vimentin表達降低，有胞膜胞漿高表達降低為胞膜胞漿低

13、表達;穩(wěn)定表達株FOXK1-pcDNA3.1-SW480、 pcDNA3.1-SW480，瞬時轉染的FOXK1-siRNA-SW480、Scr-siRNA-SW480四組細胞進行Western-blotting發(fā)現(xiàn)E-cadherin和γ-catenin的表達隨FOXK1升高而降低，隨FOXK1的表達降低而升高。
　　4、壓低FOXK1可逆轉rTGF-β1引起的EMT影響
　　4.1、rTGF-β1以時間依賴的方式誘導FOX

14、K1和EMT相關蛋白的表達
　　rTGF-β1作用后0H、24H、48H觀察，SW480和SW1116細胞中FOXK1表達量隨作用時間的增加而遞增，同時EMT相關蛋白的間質標識蛋白vimentin的表達亦出現(xiàn)遞增，E-cadherin則隨著rTGF-β1作用時間的增加而表達降低。
　　4.2、低表達FOXK1阻斷rTGF-β1對FOXK1及EMT的誘導作用
　　對照組的SW1116細胞和SW480細胞在加入rTGF-β

15、1后細胞變得細長，并伸出觸角、偽足，而E-cadherin表達降低、Vimentin表達增加;Transwell試驗中穿過基底膜的細胞也增加;但是通過轉染FOXK1-siRNA后，纖長有觸角、偽足的腸癌細胞再次變得短圓，而E-cadherin表達升高，vimentin的表達降低，侵襲試驗中穿過基底膜的細胞數(shù)亦大大減少。以上數(shù)據(jù)均表明低表達FOXK1阻斷rTGF-β1對FOXK1及EMT的誘導作用。
　　5、壓低FOXK1表達對體內

16、腫瘤侵襲轉移作用的影響
　　5.1、慢病毒FOXK1-shRNA轉染SW480細胞后FOXK1表達降低
　　Western blotting顯示轉染慢病毒FOXK1-shRNA的SW480細胞相對于對照組，F(xiàn)OXK1表達量明顯下降。綠色熒光顯示:在96小時，熒光強度和范圍達到95％以上。
　　5.2、FOXK1可誘導裸鼠體內腫瘤轉移及EMT過程
　　SW480/pEGFP-FOXK1和 SW480/pEGFP-N

17、1(Vector)，或SW480/pEGFP-FOXK1 shRNA和SW480/pEGFP-src shRNA相比較，F(xiàn)OXK1高表達組的SW480引起的腫瘤更大。HE染色證實肝組織中存在轉移的腸癌腺體細胞。免疫組織化學明確正常肝細胞中E-cadherin的表達較FOXK1高表達細胞所引起的肝臟轉移癌組織的更高，qRT-PCR驗證得到SW480/pEGFP-N1(Vector)較SW480/pEGFP-FOXK1組E-cadherin

18、表達高，說明低表達FOXK1可以抑制腸癌細胞的轉移能力，高表達FOXK1可以促進長癌細胞的轉移能力，并且高表達FOXK1可促進轉移癌中的EMT過程。
　　結論:
　　1、FOXK1在原發(fā)結直腸癌及淋巴結轉移癌中均呈現(xiàn)高表達
　　2、低表達FOXK1抑制結直腸癌細胞EMT、遷移、侵襲
　　3、低表達FOXK1可逆轉rTGF-β1誘導的結直腸癌細胞EMT、侵襲作用
　　4、動物實驗證實低表達FOXK1可抑制結直