PRL-3-stathmin相互作用對結(jié)直腸癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的最重要的因為,也是結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的直接因為。結(jié)直腸癌的演進是多因素,多水平,多通路的復(fù)雜過程。因此,篩選其發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并闡明其相關(guān)分子機制,將對臨床結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)防、治療具有重要意義。促肝細胞再生磷酸酶-3(Phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3),屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(proteintyrosin

2、e phosphatase)家族(PRL-1、PRL-2、PRL-3)成員,其蛋白的相對分子量約為19KD,它通過調(diào)節(jié)酪氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)實現(xiàn)對蛋白質(zhì)活性的調(diào)控。目前證實PRL-3與人結(jié)直腸癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。PRL-3在正常結(jié)直腸上皮中幾乎不表達,在原發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤組織中不表達或低表達,而在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶(尤其是肝臟)中高表達。PRL-3的上調(diào)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PRL-3是細胞粘附和上皮間葉轉(zhuǎn)化的重要的調(diào)節(jié)因子

3、,通過增強整合素相關(guān)Src信號及PI-3K/AKT信號通路促進EMT(epithelial msenchymal transition)的發(fā)生,調(diào)節(jié)RhoGTP酶家族信號通路、細胞周期等。我們的前期課題實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRL-3可直接調(diào)節(jié)鈣粘附蛋白(Cadherin)促進EMT發(fā)生。除此之外,PRL-3也是重要的細胞周期調(diào)節(jié)因子。但其相互作用的底物仍然不太清楚。
　　 Integrinα1是最先報道的與PRL-3相互作用蛋白,我們課

4、題組通過酵母雙雜交技術(shù)及免疫共沉淀方法篩選并證實PRL-3另一相互作用蛋白CDH22；國外通過蛋白組學(xué)方法成功篩選出PRL-3部分作用底物及相互作用蛋白--ezrin、cytokeratin 8、the elongation factor 2(EF2)。
　　 為了進一步了解PRL-3在結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移中的功能和作用,我們運用蛋白組學(xué)策略檢測PRL-3瞬時敲低24小時、48小時及穩(wěn)定敲低結(jié)直腸癌細胞后蛋白水平的改變,運用基質(zhì)輔

5、助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-AssistedLaser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometer,MALDI-TOF MS)技術(shù)鑒定出39個差異表達蛋白；其中我們發(fā)現(xiàn)致癌基因Stathmin隨著PRL-3的敲低而表達下調(diào)。Stathmin是一種小分子磷蛋白,分子量約17KD,為微管不穩(wěn)定蛋白,與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在本研究中我們將通過免疫共沉淀、免疫

6、熒光、構(gòu)建干擾及過表達載體后生物學(xué)功能等方面對兩者之間的相互作用作進一步研究。
　　 方法
　　 1、應(yīng)用蛋白組學(xué)策略篩選PRL-3相關(guān)蛋白
　　 生長狀態(tài)良好的人結(jié)直腸癌細胞株SW480、瞬時敲低PRL-324小時及48小時的SW480細胞、穩(wěn)定敲低PRL-3的SW480細胞克隆共四組,分別獲取細胞全蛋白后,行雙向凝膠電泳技術(shù)篩選PRL-3相關(guān)的差異蛋白點,通過MALDI-TOF MS分析鑒定相關(guān)蛋白。

7、　　 2、Stathmin在不同人結(jié)直腸癌細胞株及新鮮人結(jié)直腸癌組織中的表達及意義。
　　 隨機獲取149例新鮮人結(jié)直腸癌組織石蠟包埋后4μm切片,免疫組織化學(xué)染色檢測Stathmin的表達,Western Blot分析不同人結(jié)直腸癌細胞株中Stathmin的表達,Western Blot分析人結(jié)直腸癌組織與其配對正常粘膜組織中Stathmin的表達。
　　 3、Stathmin過表達和表達敲低對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)特性

8、的影響
　　 設(shè)計人Stathmin特異性引物,克隆至真核綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1,應(yīng)用PCR、酶切及DNA測序進行鑒定,確認后轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞SW480及HT29,應(yīng)用Western Blot檢測Stathmin蛋白的表達；設(shè)計人Stathmin基因特異性RNAi靶序列,克隆至pGPU6/GFP/Neo siRNA表達載體,應(yīng)用PCR及DNA測序進行鑒定,確認后轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細胞SW620及Lovo,應(yīng)用Weste

9、rn Blot檢測不同干擾片段對Stathmin蛋白表達的影響。
　　 利用MTT法、平板克隆形成實驗檢測Stathmin過表達對結(jié)直腸癌細胞SW480、HT29體外增殖能力的影響及Stathmin敲低后對結(jié)直腸癌細胞SW620及Lovo體外增殖的影響；應(yīng)用運動小室實驗檢測Stathmin過表達對結(jié)直腸癌細胞SW480、HT29運動和遷移能力的影響及Stathmin.敲低后對結(jié)直腸癌細胞SW620及Lovo遷移能力的影響；應(yīng)用細

10、胞粘附實驗測定Stathmin過表達對結(jié)直腸癌細胞SW480、HT29粘附能力的影響及Stathmin敲低對結(jié)直腸癌細胞SW620、Lovo粘附能力的影響。
　　 4、PRL-3與Stathmin的相互作用及意義
　　 生長狀態(tài)良好的人結(jié)直腸癌細胞株SW620、Lovo、SW480、HT29免疫熒光標記后共聚焦分析PRL-3與Stathmin在結(jié)直腸癌細胞內(nèi)的共定位；收集人結(jié)直腸癌細胞及結(jié)直腸癌組織蛋白后行免疫共沉淀法進

11、一步鑒定PRL-3與Stathmin在結(jié)直腸癌細胞及組織中的相互作用。
　　 免疫熒光及Western Blot觀察PRL-3與Stathmin過表達對結(jié)直腸癌細胞SW480、HT29中α-tubulin及乙酰化α-tubulin的分布和表達的影響,敲低PRL-3與Stathmin對結(jié)直腸癌細胞SW620、Lovo α-tubulin及乙酰化α-tubulin的分布和表達的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、雙向凝膠電

12、泳及質(zhì)譜分析結(jié)直腸癌細胞中PRL-3相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白
　　 在四個比較組中,通過二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(Two-DimensionalPolyacrylamide Gel Electrophoresis,2-DE)結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)成功鑒定了39個有差異的蛋白點,其中21個蛋白點在瞬時轉(zhuǎn)染24小時、48小時及穩(wěn)定敲低的SW480細胞株中均表達下調(diào)；9個蛋白點在瞬時轉(zhuǎn)染24小時、48小時及穩(wěn)定敲低的SW480細胞株中均表

13、達上調(diào)；3個蛋白點只在穩(wěn)定敲低的SW480細胞株中表達下調(diào)；6個蛋白點只在穩(wěn)定敲低的SW480細胞株中表達上調(diào)。有意義的是,癌基因Stathmin/OP18隨著PRL-3的表達下調(diào)而下調(diào)。
　　 2、Stathmin在結(jié)直腸癌細胞及組織中的表達
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示Stathmin定位于結(jié)直腸癌細胞胞漿；正常結(jié)直腸組織Stathmin不表達或弱表達,結(jié)直腸癌組織中Stathmin的表達明顯高于正常結(jié)直腸組織；在

14、淋巴結(jié)與肝臟轉(zhuǎn)移灶中Stathmin強表達。Stathmin的表達與性別、年齡、腫瘤的大小及范圍差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但是,Stathmin的表達與結(jié)直腸癌患者腫瘤的分化(x2=6.656,P=0.010)、浸潤(x2=7.762,P=0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(x2=33.888,P=0.000)、Dukes分級(x2=37.480,P=0.000)、TNM分期(x2=42.155,P=0.000)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kap

15、lan-Meier分析方法及Log-rank test發(fā)現(xiàn)Stathmin的表達與結(jié)直腸癌患者的生存時間存在顯著相關(guān)性(x2=53.205,P=0.000)；采用多變量COX回歸分析患者生存時間與腫瘤浸潤、分化、Duke's分級、TNM分期、Stathmin表達的關(guān)系。結(jié)果顯示Stathmin表達可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個潛在的獨立預(yù)測因子(x2=48.012,P=0.000)。
　　 在隨機挑選的4對結(jié)直腸癌組織及其配對正常

16、粘膜組織中Western Blot結(jié)果顯示Stathmin表達在原發(fā)結(jié)直腸癌組織中明顯高于其配對正常粘膜組織；在發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)結(jié)直腸癌組織中Stathmin的表達明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)結(jié)直腸癌組織。在不同的結(jié)直腸癌細胞株中,在轉(zhuǎn)移能力較強的細胞株SW620、Lovo、HCT116中Stathmin的表達較強；而在低轉(zhuǎn)移潛能的細胞株SW480、HT29、LS174T中Stathmin的表達較弱。
　　 3、應(yīng)用Stathmin過

17、表達載體及Stathmin RNA干擾載體轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞后觀察其對結(jié)直腸癌細胞的生物學(xué)特性影響
　　 4、Stathmin是PRL-3相互作用蛋白
　　 免疫共沉淀分析結(jié)果表明,在不同結(jié)直腸細胞株中和不同結(jié)直腸癌組織中PRL-3與Stathmin存在直接相互作用；在不同結(jié)直腸癌細胞株SW480、SW620、LOVO、HT29細胞中PRL-3與Stathmin共定位分析也支持二者存在相互作用。
　　 結(jié)論

18、>　　 1.應(yīng)用蛋白組學(xué)策略成功篩選出39個PRL-3調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白,其中Stathmin/OP18蛋白隨著PRL-3表達的下調(diào)而下調(diào):
　　 2.Stathmin/OP18在結(jié)直腸癌組織及淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移灶組織中的表達明顯高于正常結(jié)直腸粘膜組織；發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中stathmin的表達明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織,可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個潛在的獨立預(yù)測因子；
　　 3.Stathmin/OP18促進結(jié)直腸癌細