棉花GhCNGC2基因的克隆與功能鑒定和夏威夷海洋海綿的真菌多樣性分析.pdf

1、高等植物的生長和發(fā)育需要吸收大量的營養(yǎng)物質(zhì)和離子,它們對(duì)植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),滲透調(diào)節(jié)以及代謝都是至關(guān)重要的。因此,植物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的調(diào)節(jié)成為一種影響植物內(nèi)部營養(yǎng)平衡的重要機(jī)制。近年來,作為一種重要的離子吸收機(jī)制,植物細(xì)胞對(duì)于營養(yǎng)離子的單方向吸收運(yùn)輸引起了越來越多研究者的興趣,但早期的一些研究卻主要集中在那些高選擇性的離子通道上。然而最近的研究表明,植物對(duì)離子的吸收很大程度上是依靠一些非選擇性陽離子離子通道(non-selective ca

2、tion channel, NSCC)來實(shí)現(xiàn)的。通常來說,這類離子通道對(duì)陽離子具有很高的透過性,卻完全不能傳導(dǎo)陰離子：它們對(duì)于-價(jià)的陽離子具有廣泛的滲透性,有時(shí)也可以傳導(dǎo)一些二價(jià)的陽離子。環(huán)化核苷酸調(diào)節(jié)的離子通道(cyclic nucleotide-gated cation channel, CNGC)就是一種非選擇性的陽離子通道。 環(huán)化核苷酸調(diào)節(jié)的離子通道蛋白是一種在動(dòng)、植物中廣泛存在的非選擇性的陽離子通道。在動(dòng)物中,CNG

3、C是一種受環(huán)化核苷酸(cNMP)調(diào)節(jié)的視覺和嗅覺的傳感器；在植物中,有關(guān)CNGC的研究還相對(duì)較少,只是在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大麥(Hordeum vulgare)和煙草(Nicotiana tabacum)中有過少量的研究報(bào)道,因此對(duì)它們功能的了解還是非常有限,通常認(rèn)為它們與植物的離子傳遞以及抗病性有關(guān)。 棉花是一種纖維用經(jīng)濟(jì)作物,它具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和研究價(jià)值。本文以耐鹽棉花品種中棉19(ZM

4、19)為試驗(yàn)材料,構(gòu)建了鹽誘導(dǎo)的棉花幼苗葉片cDNA文庫,并通過反向northern差異篩選法從中分離得到了一個(gè)與鹽脅迫相關(guān)的克隆GhCNGC2。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因可能編碼一種環(huán)化核苷酸調(diào)節(jié)的離子通道蛋白,并對(duì)該基因的功能和分子機(jī)制進(jìn)行了探索。主要結(jié)果如下： 1.利用Clontech SmartTM cDNA Library Construction Kit構(gòu)建鹽脅迫誘導(dǎo)的棉花幼苗葉片cDNA文庫,通過反向:northe

5、rn差異篩選法獲得一個(gè)與鹽脅迫相關(guān),長度為670 bp的克隆。設(shè)計(jì)特異引物,通過5'-RACE和3'-RACE PCR,克隆得到該基因的5’片段和3’片段,根據(jù)重疊片段進(jìn)行拼接,再用特異引物擴(kuò)增得到2388 bp的全長cDNA,其編碼區(qū)全長為2145 bp,編碼一個(gè)715個(gè)氨基酸的蛋白,推測(cè)其分子量為78 kDa。 2.通過對(duì)該基因編碼的蛋白同源性比較發(fā)現(xiàn),該蛋白與植物的CNGCs家族具有較高的同源性,其中與擬南芥的AtCNG

6、C2的蛋白同源性達(dá)到74.90％。聚類分析也表明,該基因編碼的蛋白與擬南芥、水稻、大麥以及煙草中的CNGC序列也有一定的親緣關(guān)系。因此,我們推測(cè),該基因所編碼的蛋白產(chǎn)物可能是一種環(huán)化核苷酸調(diào)節(jié)的離子通道,將該基因命名為GhCNGC2。 3.跨膜結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的進(jìn)一步分析表明,GhCNGC2的氨基端有6個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域(S1-S6),在第5個(gè)和第6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間還有一個(gè)孔狀結(jié)構(gòu)域(Pore region);在羧基端有一個(gè)保

7、守的環(huán)化核苷酸結(jié)合域(CNBD)和一個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合域(CaMBD),這些都是植物環(huán)化核苷酸調(diào)節(jié)的離子通道的典型序列特征。 4.Northern blot表達(dá)分析表明,GhCNGC2在棉花葉片(子葉)中具有較高的表達(dá)水平,在莖中的表達(dá)水平較低,而在根中檢測(cè)不到該基因的表達(dá)。GhCNGC2還受到多種脅迫的誘導(dǎo),其中在NaCl處理的棉花幼苗中表達(dá)明顯增加,而甘露醇和ABA處理也產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo),低溫、Cu2+和乙烯的誘導(dǎo)相對(duì)較弱。對(duì)不同

8、萌發(fā)時(shí)期的棉花幼苗進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)該基因在不同的萌發(fā)時(shí)期表達(dá)水平基本不變。 5.酵母互補(bǔ)試驗(yàn)證明,GhCNGC2作為一種離子通道,其K+的吸收能力在酵母突變體CY162中受到了內(nèi)源鈣調(diào)素的極大抑制,而表達(dá)GhCNGC2的缺失形式GhCNGC2ΔCaM和GhCNGC2ΔCNBD則可以使該突變體重新獲得K+的吸收能力,從而互補(bǔ)該突變體,這表明CNBD和CaMBD作為羧基端調(diào)節(jié)區(qū)域的兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域,對(duì)GhCNGC2的功能起到了重要的調(diào)

9、節(jié)作用。 6.轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源離子含量測(cè)定的結(jié)果顯示,超表達(dá)GhCNGC2及其缺失形式的擬南芥植株可以促進(jìn)K+的吸收,抑制Na+的吸收,同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)較高的K+/Na+比值,這表明該基因可能與脅迫條件下的種子萌發(fā)有密切關(guān)系。 7.相比野生型擬南芥,超表達(dá)GhCNGC2基因及其缺失形式的轉(zhuǎn)基因種子在高鹽、鹽堿、干旱、高溫等各種脅迫條件下表現(xiàn)出較高的萌發(fā)率,說明GhCNGC2可能與種子萌發(fā)階段的脅迫抗性緊密相關(guān)。另外,三種轉(zhuǎn)

10、基因種子所表現(xiàn)出來的萌發(fā)率高低關(guān)系可能是受到了環(huán)化核苷酸以及鈣調(diào)素的雙重調(diào)節(jié)。 海洋真菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的生物群落,由于其特殊的生存環(huán)境,以前對(duì)其研究較少。隨著人們對(duì)海洋認(rèn)識(shí)的深化,海洋生物的研究將成為二十一世紀(jì)生物研究的熱點(diǎn)之一。海綿屬于多孔動(dòng)物門,在全球包括15000多種,分屬于3個(gè)綱：鈣質(zhì)海綿綱(Calcarea)、六放海綿綱(Hexactinellida)和尋常海綿綱(Demopongiae)。作為濾食性動(dòng)物,

11、一千克的海綿組織一天可以過濾海水達(dá)24000升,海綿可以有效的從周圍的海水環(huán)境中獲取食物。各種浮游微生物都可以作為共附生微生物,生長在海綿的中質(zhì)層中。 共附生微生物的存在對(duì)寄主生物的健康和生活環(huán)境起到非常重要的作用。雖然在海洋海綿中共附生的原核生物已經(jīng)被廣泛的鑒定,但是人們還尚未使用過分子生物學(xué)的方法研究海綿中真菌群落的多樣性。真菌是許多海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分,它們也是海洋海綿中非常重要的一種生態(tài)群。 本研

12、究對(duì)現(xiàn)有的研究海綿中真菌群落的引物進(jìn)行了可行性分析,選取了8對(duì)引物,分別構(gòu)建rRNA或ITS克隆文庫,都沒有得到滿意的結(jié)果；同時(shí)選取了11組DGGE引物,這些引物可以很好地?cái)U(kuò)增一些陸地環(huán)境樣品中真菌的rRNA或ITS序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有3組能夠成功地?cái)U(kuò)增海洋海綿中的真菌序列。DGGE結(jié)果顯示,兩種不同的夏威夷海洋海綿(Suberites zeteki和Mycale armata)中的真菌群落存在明顯的差異,同時(shí)在海洋海綿和海水樣品中的真菌

13、群落也存在一定的差異。通過對(duì)所得DGGE條帶的測(cè)序,在海綿S.zeteki中鑒定了23種真菌的存在；而在海綿M. armata中鑒定了21種真菌的存在。這些真菌屬于11個(gè)不同的目,其中包括子囊菌門(Adscomycota)7個(gè)目,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)4個(gè)目,并且有5個(gè)目(Malasseziales, Corticiales, Polyporales, Agaricales和Dothideomycetes et Chae

14、tothyriomcetes incertae sedis)是在海洋海綿中的首次鑒定。在S. zeteki和M. armata中,分別有7個(gè)和6個(gè)可能的真菌新種被鑒定出來,這些序列與它們?cè)贕enBank中的對(duì)應(yīng)序列的序列相似性小于98％。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),這些來自于海洋海綿的真菌序列與一些其他的來自于海洋生境的序列一起屬于“海洋真菌”進(jìn)化支。 本研究是首次應(yīng)用分子生物學(xué)的方法鑒定海洋海綿中的真菌群落,為以后進(jìn)一步的研究海綿共附