甘草酸對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其免疫學(xué)機(jī)理研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 甘草酸對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響
　　目的:探討甘草酸(GA)對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其可能作用機(jī)制。
　　方法:通過建立支氣管哮喘小鼠動(dòng)物模型，以25、50、100 mg/kg三種不同濃度的GA進(jìn)行干預(yù)，末次激發(fā)后24 h采用動(dòng)物肺功能儀對(duì)各組小鼠的氣道反應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定;收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞分類數(shù)量;ELISA法檢測(cè)各組小

2、鼠血漿總IgE、OVA-特異IgE水平和BALF上清液中IL-12p70、IL-10、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平;肺組織HE染色;免疫組化法檢測(cè)肺組織中趨化因子Eotaxin、MCP-1和CINC-1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)哮喘組小鼠具有典型的哮喘發(fā)作樣癥狀，各濃度GA干預(yù)組小鼠上述反應(yīng)較輕。(2)各組小鼠肺阻力(RL)和肺順應(yīng)性(Cdyn)基礎(chǔ)值相近，肺阻力隨著激發(fā)液乙酰甲膽堿劑量的升高而增加，而肺順應(yīng)

3、性則隨著激發(fā)液乙酰甲膽堿劑量的升高而降低;在同等劑量乙酰甲膽堿(0.050、0.100、0.200 mg/kg)激發(fā)時(shí)，哮喘組小鼠RL顯著高于對(duì)照組，而肺Cdyn顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05）;在乙酰甲膽堿劑量分別為0.100、0.200 mg/kg激發(fā)時(shí)，中、高濃度GA組的RL顯著低于哮喘組，而肺Cdyn顯著高于哮喘組（均P＜0.05）。(3)哮喘組小鼠血漿總IgE、OVA-特異IgE水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0

4、5）;GA干預(yù)組血漿IgE、OVA-特異IgE水平低于哮喘組，且在中、高濃度干預(yù)組中尤其明顯（均P＜0.05）。(4)哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)及Eos、Lym和Neu計(jì)數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05);高濃度GA干預(yù)組BALF中細(xì)胞總數(shù)及Eos、Lym和Neu計(jì)數(shù)均低于哮喘組（P值均＜0.05）。(5)哮喘組BALF中IL-12p70水平低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;中、高濃度GA干預(yù)組BALF中

5、IL-12p70水平均顯著高于哮喘組（均P＜0.05）。哮喘組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;中、高濃度GA干預(yù)組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平低于哮喘組（均P＜0.05）。哮喘組BALF中IL-10的水平高于對(duì)照組(t=3.373，P＜0.05)，各濃度GA干預(yù)組BALF中IL-10水平顯著高于哮喘組（組間F值為54.187，P＜0.05）;哮喘組小鼠

6、BALF中IFN-γ水平顯著低于對(duì)照組(t=4.971，P＜0.05)，中、高濃度GA干預(yù)組小鼠BALF中IFN-γ的水平顯著高于哮喘組（均P＜0.05）;哮喘組BALF中IFN-γ/IL-4比值顯著低于對(duì)照組（t=6.943，P＜0.05），中、高濃度GA干預(yù)組IFN-γ/IL-4比值均顯著高于哮喘組（組間F值為17.533，P＜0.05）。(6)哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，氣道壁及管周有大量以Eos為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，各GA組氣道炎

7、癥反應(yīng)較哮喘組輕，在中、高濃度GA組尤其明顯。(7)哮喘組Eotaxin、MCP-1和CINC-1蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(均P＜0.05)，中、高濃度GA干預(yù)組小鼠Eotaxin、MCP-1和CINC-1蛋白的表達(dá)低于哮喘組(均P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)GA能夠降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性，減少BALF中細(xì)胞總數(shù)和Eos、Lym和Neu分類計(jì)數(shù)，降低血漿總IgE、OVA-特異IgE水平，增加哮喘小鼠BALF中IL-10、IL

8、-12p70和IFN-γ水平，降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量;(2)GA可以下調(diào)哮喘組小鼠肺組織中趨化因子Eotaxin、MCP-1和CINC-1的表達(dá);(3)GA可能通過影響Th1/Th2平衡，減輕哮喘氣道炎癥。
　　第二部分 甘草酸對(duì)支氣管哮喘小鼠OX40/OX40L/p38 MAPK信號(hào)通路的影響
　　目的:探討甘草酸(GA)對(duì)支氣管哮喘小鼠OX40/OX40L/p38 MAPK信號(hào)通路的影響。

9、>　　方法:第一部分支氣管哮喘小鼠模型實(shí)驗(yàn)分組，RT-PCR法檢測(cè)肺OX40、OX40L的mRNA表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)哮喘小鼠脾臟CD11c+樹突細(xì)胞(DCs)表面CD86、MHC-Ⅱ、CD40和OX40L的表達(dá)、T細(xì)胞表面OX40和B細(xì)胞、單核細(xì)胞表面OX40L的表達(dá)情況;免疫組化法檢測(cè)肺組織中OX40、OX40L、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的蛋白表達(dá);Western Blotting法檢測(cè)肺組織

10、p38MAPK、p-p38 MAPK的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)哮喘組小鼠肺組織OX40和OX40L的mRNA表達(dá)高于對(duì)照組（均P＜0.05），各濃度GA干預(yù)組小鼠肺組織OX40和OX40L的mRNA相對(duì)灰度值低于哮喘組，呈濃度依賴趨勢(shì)（均P＜0.05）。(2)哮喘組小鼠脾臟CD11c+ DCs表面CD86、MHC-Ⅱ、CD40和OX40L分子的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（均P＜0.05），經(jīng)GA干預(yù)后MHC-Ⅱ、CD40和OX40

11、L分子的表達(dá)均有不同程度的下降，呈濃度依賴趨勢(shì)（均P＜0.05）。
　　結(jié)論:(1)GA可以抑制哮喘小鼠肺組織OX40和OX40L的mRNA表達(dá)，削弱哮喘小鼠肺組織和脾臟OX40和OX40L的蛋白表達(dá)，此抑制作用呈濃度依賴趨勢(shì);(2)GA可以影響DCs表面MHC-Ⅱ、CD40和OX40L分子的表達(dá)。
　　第三部分 甘草酸對(duì)支氣管哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞增殖和OX40/OX40L/p38 MAPK信號(hào)通路的影響
　　目

12、的:探討甘草酸(GA)對(duì)支氣管哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞增殖和OX40/OX40L/p38 MAPK信號(hào)通路的影響。
　　方法:通過磁珠分選建立支氣管哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，分別以anti-CD3 mAb(1μg/ml)和anti-OX40 mAb(2.5μg/ml)刺激后，以不同濃度的GA或p38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)以IgG或DMSO作為對(duì)照，培養(yǎng)72 h后，運(yùn)用CCK8法檢

13、測(cè)哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的增殖能力;運(yùn)用ELISA法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ細(xì)胞因子的含量;同時(shí)運(yùn)用Western Blotting法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞p38 MAPK、p-p38 MAPK的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)支氣管哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞經(jīng)anti-CD3 mAb處理后，OD值較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;三種不同濃度的GA干預(yù)后，其OD值較C

14、D3組下降，其中濃度為10μg/ml和100μg/ml的GA組尤著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）;支氣管哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞經(jīng)anti-CD3 mAb激發(fā)后，再以anti-OX40 mAb（2.5μg/ml）處理，其增殖能力明顯提高，CD3+OX40組OD值較CD3+IgG組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);三種不同濃度的GA干預(yù)后，其OD值較CD3+OX40+DMSO組下降，其中濃度為1Oμg/ml和100μg/

15、ml的GA組尤著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;p38 MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后，CD4+T細(xì)胞的增殖能力減弱，OD值較CD3+OX40+DMSO組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(2)哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞經(jīng)anti-CD3 mAb和anti-OX40 mAb處理后，CD3+OX40組培養(yǎng)上清液IL-4、IL-5、IL-13的含量較Control組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）;GA和SB2

16、03580均可抑制IL-4、IL-5、IL-13的分泌，對(duì)于IL-4和IL-13來說，中、高濃度GA和SB203580組較CD3+OX40+DMSO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）;對(duì)于IL-5來說，僅高濃度GA和SB203580組較CD3+OX40+DMSO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞經(jīng)anti-CD3 mAb刺激后，IFN-γ的含量明顯增高，CD3組較Control組明顯增高，差異

17、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）組;再以anti-OX40 mAb處理后，CD3+OX40組的IFN-γ水平較CD3+IgG組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中、高濃度GA和SB203580組的IFN-γ水平較CD3+OX40+DMSO組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:(1)OX40/OX40L共刺激信號(hào)分子在CD4+T細(xì)胞體外增殖和分泌細(xì)胞因子方面具有重要作用;(2)p38 MAPK抑制劑可以阻斷OX4