支氣管哮喘小鼠模型氣道血管再生與重塑的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本試驗(yàn)將詳細(xì)闡明支氣管哮喘氣道血管特異性改變以及血管再生和重塑相關(guān)影響因子的作用。 研究材料與方法： 1、小鼠支氣管哮喘模型的制備： 雄性清潔級(jí)A/J小鼠30只，5周大，分成三組，A組：正常對(duì)照組；B組：急性早期支氣管哮喘組；C組：慢性延長(zhǎng)期支氣管哮喘組。每組10只，試驗(yàn)開(kāi)始0，28，42，56天B組C組小鼠分別給予10ug卵清蛋白(ovalbumin，OVA)+2mg氫氧化鋁凝膠腹膜內(nèi)注射，之后，應(yīng)用超生霧化裝

2、置(3ml/min)進(jìn)行OVA霧化(20mg/ml)， B組每日一次，共1周，C組每日一次共5周，A組吸入0.9％生理鹽水。 2、氣道反應(yīng)性檢測(cè)： 最后一次吸入OVA24小時(shí)后開(kāi)始檢測(cè)氣道反應(yīng)性。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將小鼠放到全身體積描記儀(Buxco Electronics，Troy,NY)上檢測(cè)氣道阻力(Raw)，測(cè)得的數(shù)據(jù)表示為Raw百分?jǐn)?shù)，用下面的公式得出： (吸入Ach之后的Raw/吸入之前的Raw)×10

3、0％。 3、血管灌注，小鼠處死，留取血清，肺泡灌洗液和肺組織肺泡灌洗液細(xì)胞成份計(jì)數(shù)。ELISA法檢測(cè)血清總IgE和OVA特異性IgE水平及肺泡灌洗液IL-4，IL-5水平。 4、冰凍切片HE染色及免疫熒光染色冰凍肺組織于冰凍切片機(jī)上切片(4-6urn)，進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察并照相。 簡(jiǎn)述雙重及三重免疫熒光染色過(guò)程如下：冰凍切片冰丙酮固定10分鐘，0.01MPBS洗片后加正常10％羊血清(Sigma，MO，U

4、SA)室溫20分鐘，一抗4℃孵育過(guò)夜，0.01PBS洗片后加二抗室溫2小時(shí)，0.01PBS洗片后甘油封片。三重染色時(shí)二抗室溫2小時(shí)0.01PBS洗片后加TOTO-3(1：10000)核染，室溫30分鐘，0.01PBS洗片后甘油封片。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(model TC-SP,Leica，Heidelberg，Germany)察表達(dá)，照相。 5、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)VEGF/VEGFR和PDGFB/PDGFRp

5、基因表達(dá)應(yīng)用RNeasy Mini Kit(Qiagen；Hilden，Gemany)從氣管及肺組織中提取總RNA，每個(gè)標(biāo)本取相同質(zhì)量的總RNA 2ug，應(yīng)用oligo(dT)及SuperScript Ⅱ RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL，Rockville，MD，USA)37℃ 1.5小時(shí)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。每個(gè)標(biāo)本取1ul cDNA混勻后取1ul進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，之后應(yīng)用SYBR Green I(

6、Molecular Probes；Eugene，OR)染色，分子顯像FX檢測(cè)電泳條帶應(yīng)用NIH成像分析軟件進(jìn)行分析。GAPDH作為內(nèi)參，相同的條件進(jìn)行檢測(cè)。 6、Westernblot法檢測(cè)VEGF/VEGFR和PDGFB/PDGFRβ蛋白表達(dá)水平蛋白提取和蛋白定量后，取等量樣品進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，經(jīng)一抗和二抗孵育后顯色。分子顯像FX檢測(cè)電泳條帶應(yīng)用NIH成像分析軟件進(jìn)行分析。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有原始數(shù)據(jù)采用Excel分

7、析軟件進(jìn)行處理分析，均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1、從生理學(xué)(哮喘組小鼠氣道反應(yīng)性明顯增高)，血清學(xué)(哮喘組小鼠血清IgE水平明顯增高)，免疫學(xué)(哮喘組小鼠肺泡灌洗液嗜酸細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，哮喘組小鼠炎性因子IL-4，IL-5水平增高)、病理學(xué)(HE染色)以及臨床表現(xiàn)方面證實(shí)了本試驗(yàn)中的小鼠模型符合支氣管哮喘。 2、FITC-右旋糖苷灌注的正常及哮喘鼠

8、切片激光共聚焦顯微鏡觀察圖片顯示：與正常比較，早期和延長(zhǎng)期哮喘鼠氣管壁血管密度明顯增加，血管擴(kuò)張，在延長(zhǎng)期氣管壁觀察到除了血管密度增加外，毛細(xì)血管明顯扭曲，擴(kuò)張，滲漏。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡圖像分析系統(tǒng)計(jì)算氣道壁血管區(qū)域面積百分比，氣管壁血管密度在慢性延長(zhǎng)期明顯增加。 3、哮喘小鼠氣管內(nèi)皮細(xì)胞及血管壁細(xì)胞(平滑肌細(xì)胞或周細(xì)胞)表型發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)的改變間接提示功能發(fā)生變化。內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)慢性哮喘時(shí)明顯增加，特別在小血管，壁細(xì)胞數(shù)急性期變

9、化較大，數(shù)量減少特別是大血管，而隨著疾病的進(jìn)展，到慢性期，平滑肌的數(shù)量基本回復(fù)正常，這說(shuō)明支氣管哮喘氣道血管重塑過(guò)程中不僅存在小血管的重塑，而且存在大血管的重塑，并且這種重塑是可逆的。 4、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到VEGF 5個(gè)亞型mRNA表達(dá)，少見(jiàn)的亞型VEGF<,144>氣管組織中無(wú)表達(dá)，周?chē)谓M織中檢測(cè)到其表達(dá)，而VEGF<,164>在氣管組織，慢性哮喘期明顯增高，VEGF<,188>在周?chē)谓M織中mR

10、NA表達(dá)在慢性哮喘期明顯增高。支氣管及肺組織的VEGFR1表達(dá)各組間無(wú)明顯差異。而VEGFR2在正常氣管組織中未檢測(cè)到，而在支氣管哮喘氣管組織明顯表達(dá)。Westemblot蛋白檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)基本一致。 5、PDGFB mRNA在正常氣管未檢測(cè)到，而在支氣管哮喘小鼠肺組織檢測(cè)到其表達(dá)。在慢性延長(zhǎng)期哮喘小鼠氣管組織PDGFB mRNA顯示出清晰的條帶。周?chē)谓M織在正常小鼠表達(dá)PDGFB mRNA，在慢性延長(zhǎng)期表達(dá)明顯增加。PDGFRβm

11、RNA的表達(dá)與PDGFB相似。Westemblot蛋白檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)基本一致。 研究結(jié)論： 1、在成功建立支氣管哮喘A/J小鼠模型的基礎(chǔ)上，支氣管哮喘小鼠模型氣道壁血管再生和重塑表現(xiàn)為：毛細(xì)血管網(wǎng)增加，擴(kuò)張，滲透性增加；血管內(nèi)皮細(xì)胞及壁細(xì)胞表型及數(shù)量發(fā)生改變，這種變化與血管大小、疾病時(shí)間相關(guān)。 2、VEGF及VEGFR在支氣管哮喘小鼠模型氣道血管再生和重建中起著重要的作用。VEGF不同的亞型在支氣管哮喘模型小