通過三點(diǎn)飽和突變定向進(jìn)化AtGSTZ.pdf

1、飽和突變技術(shù)通過構(gòu)建突變文庫可以對結(jié)構(gòu)和功能知之甚少的蛋白質(zhì)特性的重要方法，也是實(shí)驗(yàn)室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一種廣泛存在的對細(xì)胞有重要解毒作用的蛋白酶家族，具有細(xì)胞內(nèi)化合物的解毒作用。擬南芥Zeta，類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(AtGSTZ)對于自來水中的強(qiáng)致癌物質(zhì)二氯乙酸(DCA)具有專一性的降解功能。在近期的研究中，大量報(bào)道集中于保守位點(diǎn)的相關(guān)研究，但是保守位點(diǎn)的突變往往導(dǎo)致酶的失活。
　　

2、本文旨在通過對保守區(qū)域內(nèi)保守位點(diǎn)附近的非保守位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，篩選出活力提高的突變株，減少保守位點(diǎn)改變帶來的負(fù)面影響。參考已報(bào)道的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶關(guān)鍵位點(diǎn)相關(guān)研究，通過同源比對，選取了Asn71、Leu108、Gly177三個(gè)可能對該酶活性有較大影響的位點(diǎn)進(jìn)行研究，針對這三個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建AtGSTZs三點(diǎn)飽和突變文庫。在三個(gè)目的位點(diǎn)處設(shè)計(jì)兼并引物，三點(diǎn)飽和突變文庫的構(gòu)建采用交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)，從該突變庫中率選出活力較高的突變株進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測