阿莫西林單鏈抗體的定向進(jìn)化.pdf

1、青霉素類藥物在畜牧業(yè)中的大量使用必然會造成在動物性食品中的殘留。本研究旨在制備阿莫西林的單鏈抗體(ScFv)及其突變體，為建立青霉素類藥物的多殘留免疫分析方法奠定基礎(chǔ)。
　　本研究從分泌抗阿莫西林單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并利用PCR技術(shù)擴增抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因片段。將兩個基因片段以VL-Linker-VH的形式拼接成ScFv基因，將其插入表達(dá)載體，直接轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL

2、21(DE3)中表達(dá)ScFv抗體。間接競爭ELISA檢測表明，該ScFv抗體對阿莫西林等11種青霉素類藥物的IC50為8.9-53.3 ng/mL，與其母源單克隆抗體的識別性能相似。然后，采用同源建模的方法利用YASARA軟件構(gòu)建了其同源模型的三維結(jié)構(gòu)，應(yīng)用分子對接軟件AutoDock將該ScFv抗體與這11種藥物分別進(jìn)行了分子對接。結(jié)果表明，該ScFv抗體識別青霉素類藥物的結(jié)合腔由輕鏈CDR1、CDR3和重鏈CDR1、CDR3構(gòu)成，主

3、要接觸氨基酸有Asn31、Phe36、Arg100、Tyr160、Tyr226和Tyr228。之后，利用YASARA計算軟件的虛擬突變功能，對限制該ScFv抗體與阿莫西林相互作用的接觸氨基酸進(jìn)行了虛擬突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將輕鏈CDR3區(qū)第95位絲氨酸突變?yōu)樘於彼岷凸劝彼岷?，與配體的結(jié)合能顯著降低。因此，利用突變試劑盒對第95位氨基酸進(jìn)行了定向突變，獲得兩種ScFv突變體的基因，將其進(jìn)行表達(dá)后與母源ScFv抗體進(jìn)行比較。結(jié)果表明，兩種ScF

4、v突變體95D和95E對阿莫西林等11種藥物的靈敏度大大提高，IC50分別為4.1-16.6ng/mL和3.5-15.0 ng/mL。二次分子對接的結(jié)果表明，主要接觸氨基酸數(shù)量增加(Asn31、Phe36、Glu95、Arg100、Tyr160、Tyr179、Tyr226、Tyr227和Tyr228),且突變體-配體結(jié)合能均明顯降低。
　　綜上所述，本研究基于基因工程和計算模擬的方法，確定了阿莫西林ScFv抗體的分子識別機制，并實