STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件鑒定及功能位點分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:運用生物信息學(xué)預(yù)測STGC3基因啟動子,克隆并鑒定STGC3啟動子;在此基礎(chǔ)上,預(yù)測STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,分析并證實STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件;進一步探討STGC3基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對STGC3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。定點突變STGC3基因結(jié)構(gòu)位點,通過檢測基因突變后對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探討STGC3基因發(fā)揮抑瘤作用的功能性位點,本研究為闡明STGC3基因的結(jié)構(gòu)、功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供重要的實驗依據(jù)。
  方法:采

2、用生物信息學(xué)預(yù)測并分析STGC3基因啟動子區(qū),克隆最有可能的啟動子,構(gòu)建雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒,質(zhì)粒經(jīng)酶和測序鑒定,經(jīng)脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)至細(xì)胞,通過報告基因表達產(chǎn)物雙熒光素酶活性檢測,以鑒定STGC3基因啟動子區(qū)。
  在啟動子鑒定基礎(chǔ)上,預(yù)測STGC3基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合位點,采用電泳遷移率變動分析法(EMSA)及染色質(zhì)免疫共沉淀分析(ChIP)法,驗證轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合位點,從而明確該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
  采用R

3、T-PCR和Western blot檢測STGC3基因高表達的NP69細(xì)胞系和STGC3基因低表達的CNE2細(xì)胞系中Sp1的表達水平,然后運用RNAi技術(shù)干擾細(xì)胞中Sp1的表達,通過qRT-PCR和Western blot,分析Sp1低表達后對STGC3基因的影響,以驗證轉(zhuǎn)錄因子Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
  針對STGC3基因糖基化位點(656 C)、蛋白激酶C磷酸化位點(725 C)和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(913 T),3個可能

4、性功能位點,運用Stratagene定點突變技術(shù),對STGC3蛋白糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點分別進行單堿基定點突變,使656 C突變?yōu)镚,725 C突變?yōu)門,913 T突變?yōu)镚。構(gòu)建帶His標(biāo)簽的突變重組真核表達質(zhì)粒,質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、抽提、酶切及測序鑒定,轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞系。通過RT-PCR和Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測,得到穩(wěn)定表達突變
  STGC3基因的C

5、NE2細(xì)胞系。通過MTT和胎盼藍染色細(xì)胞計數(shù)法檢測STGC3基因突變對CNE2細(xì)胞生長增殖影響,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測STGC3基因突變對CNE2細(xì)胞周期以及凋亡影響,采用Western blot對凋亡相關(guān)蛋白Bax的影響,以明確STGC3基因的抑瘤功能位點。
  結(jié)果:生物信息學(xué)結(jié)果顯示,STGC3基因5’端上游的-3046bp至-46bp區(qū)域有啟動子活性,在-2992bp至-69bp間啟動子分值達0.8以上,其中-845bp至-7

6、95bp間分值最高,達到1.0。在-1140bp和-774bp處檢測到GC盒信號,在-441bp處檢測到CAAT盒信號。有兩個CpG島:分別在-1805bp至-1705bp和-900bp至-684bp間;有兩個轉(zhuǎn)錄起始位點:分別在-2348bp和-948bp處。經(jīng)不同長度的片段缺失比對,取最有可能的283bp(-1360bp至-1077bp)、281bp(-934bp至-653bp)和571bp(-500bp至+72bp)啟動子片段,構(gòu)

7、建pGL3-en283、pGL3-en281、pGL3-en571三種質(zhì)粒,與陰性對照pGL3-enhance質(zhì)粒相比,三種質(zhì)粒均具有較強的啟動子活性,三種質(zhì)粒中以pGL3-en281質(zhì)粒的啟動子活性最強。認(rèn)為-934bp至-653bp為STGC3基因核心啟動子區(qū)。
  生物信息學(xué)結(jié)果顯示,在STGC3基因核心啟動子區(qū)-934bp至-653bp區(qū)域存在21個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,其中9個為Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;當(dāng)嚴(yán)格限定參數(shù)后,結(jié)果

8、顯示,基因核心啟動子區(qū)域含有5個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,其中Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點2個。經(jīng)EMSA和ChIP實驗證實,結(jié)果顯示,STGC3基因中存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1特異性結(jié)合位點,從而鑒定出STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
  RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞組(1.12±0.05)中,轉(zhuǎn)錄因子Sp1在mRNA水平上,表達較NP69細(xì)胞組(0.33±0.02)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示

9、,CNE2細(xì)胞組(2.67±0.28)中轉(zhuǎn)錄因子Sp1在蛋白水平上,表達高于NP69細(xì)胞組(1.17±0.17),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明轉(zhuǎn)錄因子Sp1有可能負(fù)調(diào)控STGC3基因。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建3個Sp1-shRNA干擾質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測序鑒定,結(jié)果顯示,片段大小一致,序列正確,表明成功構(gòu)建了Sp1干擾載體。Sp1-shRNA干擾載體,經(jīng)qRT-PCR及western blot篩選。篩選出干擾效率高的Sp1-shRNA載

10、體,轉(zhuǎn)染至Sp1高表達的CNE2細(xì)胞系,qRT-PCR及western blot檢測STGC3基因表達,結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞系中,干擾Sp1表達后,STGC3表達增高。
  突變質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定,酶切結(jié)果顯示目的片段大小一致,測序結(jié)果顯示序列正確,成功構(gòu)建三個突變型(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T和His-STGC3-T913G)真核表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞系,突變質(zhì)粒經(jīng)RT-PCR、

11、Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,突變質(zhì)粒均表達STGC3基因mRNA和His-tag-STGC3融合蛋白質(zhì), MTT和胎盼藍染色細(xì)胞計數(shù)生長曲線結(jié)果表明,
  His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突變組對細(xì)胞的生長增殖抑制能力降低,與野生型組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);His-STGC3-T913G突變組不影響細(xì)胞生長增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,His-STGC3-C65

12、6G組(1.20%±0.13%)和His-STGC3-C725T組(1.50%±0.26%),細(xì)胞凋亡率降低,與His-STGC3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),三個突變組對細(xì)胞生長周期無影響。Western Blot對凋亡相關(guān)蛋白Bax檢測,結(jié)果顯示,His-STGC3-C656G和
  His-STGC3-C725T突變組Bax蛋白表達降低,與野生型His-STGC3組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  

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