STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件鑒定及功能位點(diǎn)分析.pdf

1、目的：運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測STGC3基因啟動(dòng)子，克隆并鑒定STGC3啟動(dòng)子；在此基礎(chǔ)上，預(yù)測STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，分析并證實(shí)STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；進(jìn)一步探討STGC3基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對STGC3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。定點(diǎn)突變STGC3基因結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，通過檢測基因突變后對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討STGC3基因發(fā)揮抑瘤作用的功能性位點(diǎn)，本研究為闡明STGC3基因的結(jié)構(gòu)、功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采

2、用生物信息學(xué)預(yù)測并分析STGC3基因啟動(dòng)子區(qū)，克隆最有可能的啟動(dòng)子，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)酶和測序鑒定，經(jīng)脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)至細(xì)胞，通過報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物雙熒光素酶活性檢測，以鑒定STGC3基因啟動(dòng)子區(qū)。
　　在啟動(dòng)子鑒定基礎(chǔ)上，預(yù)測STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合位點(diǎn)，采用電泳遷移率變動(dòng)分析法(EMSA)及染色質(zhì)免疫共沉淀分析(ChIP)法，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合位點(diǎn)，從而明確該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
　　采用R

3、T-PCR和Western blot檢測STGC3基因高表達(dá)的NP69細(xì)胞系和STGC3基因低表達(dá)的CNE2細(xì)胞系中Sp1的表達(dá)水平，然后運(yùn)用RNAi技術(shù)干擾細(xì)胞中Sp1的表達(dá)，通過qRT-PCR和Western blot，分析Sp1低表達(dá)后對STGC3基因的影響，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　針對STGC3基因糖基化位點(diǎn)（656 C）、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（725 C）和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(913 T），3個(gè)可能

4、性功能位點(diǎn)，運(yùn)用Stratagene定點(diǎn)突變技術(shù)，對STGC3蛋白糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)分別進(jìn)行單堿基定點(diǎn)突變，使656 C突變?yōu)镚，725 C突變?yōu)門，913 T突變?yōu)镚。構(gòu)建帶His標(biāo)簽的突變重組真核表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、抽提、酶切及測序鑒定，轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞系。通過RT-PCR和Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測，得到穩(wěn)定表達(dá)突變
　　STGC3基因的C

5、NE2細(xì)胞系。通過MTT和胎盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測STGC3基因突變對CNE2細(xì)胞生長增殖影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測STGC3基因突變對CNE2細(xì)胞周期以及凋亡影響，采用Western blot對凋亡相關(guān)蛋白Bax的影響，以明確STGC3基因的抑瘤功能位點(diǎn)。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)結(jié)果顯示，STGC3基因5’端上游的－3046bp至－46bp區(qū)域有啟動(dòng)子活性，在－2992bp至－69bp間啟動(dòng)子分值達(dá)0.8以上，其中－845bp至－7

6、95bp間分值最高，達(dá)到1.0。在－1140bp和－774bp處檢測到GC盒信號(hào)，在－441bp處檢測到CAAT盒信號(hào)。有兩個(gè)CpG島：分別在－1805bp至－1705bp和－900bp至－684bp間；有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：分別在－2348bp和－948bp處。經(jīng)不同長度的片段缺失比對，取最有可能的283bp（－1360bp至－1077bp）、281bp（－934bp至－653bp）和571bp（－500bp至＋72bp）啟動(dòng)子片段，構(gòu)

7、建pGL3-en283、pGL3-en281、pGL3-en571三種質(zhì)粒，與陰性對照pGL3-enhance質(zhì)粒相比，三種質(zhì)粒均具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，三種質(zhì)粒中以pGL3-en281質(zhì)粒的啟動(dòng)子活性最強(qiáng)。認(rèn)為－934bp至－653bp為STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)。
　　生物信息學(xué)結(jié)果顯示，在STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)－934bp至－653bp區(qū)域存在21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中9個(gè)為Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)嚴(yán)格限定參數(shù)后，結(jié)果

8、顯示，基因核心啟動(dòng)子區(qū)域含有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)2個(gè)。經(jīng)EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，結(jié)果顯示，STGC3基因中存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1特異性結(jié)合位點(diǎn)，從而鑒定出STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
　　RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞組(1.12±0.05)中，轉(zhuǎn)錄因子Sp1在mRNA水平上，表達(dá)較NP69細(xì)胞組(0.33±0.02)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示

9、，CNE2細(xì)胞組(2.67±0.28)中轉(zhuǎn)錄因子Sp1在蛋白水平上，表達(dá)高于NP69細(xì)胞組(1.17±0.17)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明轉(zhuǎn)錄因子Sp1有可能負(fù)調(diào)控STGC3基因。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建3個(gè)Sp1-shRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定，結(jié)果顯示，片段大小一致，序列正確，表明成功構(gòu)建了Sp1干擾載體。Sp1-shRNA干擾載體，經(jīng)qRT-PCR及western blot篩選。篩選出干擾效率高的Sp1-shRNA載

10、體，轉(zhuǎn)染至Sp1高表達(dá)的CNE2細(xì)胞系，qRT-PCR及western blot檢測STGC3基因表達(dá)，結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞系中，干擾Sp1表達(dá)后，STGC3表達(dá)增高。
　　突變質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定，酶切結(jié)果顯示目的片段大小一致，測序結(jié)果顯示序列正確，成功構(gòu)建三個(gè)突變型（His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T和His-STGC3-T913G）真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE2細(xì)胞系，突變質(zhì)粒經(jīng)RT-PCR、

11、Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，突變質(zhì)粒均表達(dá)STGC3基因mRNA和His-tag-STGC3融合蛋白質(zhì)， MTT和胎盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)生長曲線結(jié)果表明，
　　His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突變組對細(xì)胞的生長增殖抑制能力降低，與野生型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；His-STGC3-T913G突變組不影響細(xì)胞生長增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，His-STGC3-C65

12、6G組（1.20％±0.13%）和His-STGC3-C725T組（1.50%±0.26%），細(xì)胞凋亡率降低，與His-STGC3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三個(gè)突變組對細(xì)胞生長周期無影響。Western Blot對凋亡相關(guān)蛋白Bax檢測，結(jié)果顯示，His-STGC3-C656G和
　　His-STGC3-C725T突變組Bax蛋白表達(dá)降低，與野生型His-STGC3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。