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文檔簡介
1、第一部分:良性永生化前列腺上皮細胞LH/LE對TRAIL不同敏感性及其機制研究
目的:腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)可選擇性誘導某些腫瘤細胞凋亡,而對絕大多數正常細胞無毒性作用,這一特性使TRAIL在抗腫瘤治療中具有很好的應用前景。本研究是為了明確良性永生化前列腺上皮細胞LH/LE對TRAIL的不同敏
2、感性及其機制。
方法:正常前列腺上皮細胞通過導入猿猴空泡病毒40(SV40)大T抗原和端粒酶末端轉移酶催化亞單位(hTERT),使其永生化,得到LH細胞;在這基礎上又導入SV40小T抗原片段,得到LE細胞。TRAIL作用于這兩種細胞后,MTT法檢測細胞活力,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變和流式細胞術檢測細胞凋亡狀態(tài)。Western blot檢測PP2A和c-Fos的蛋白表達。TRAIL處理LH和LE細胞后檢測PP2A酶活性。S
3、PSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
結果:LH細胞對TRAIL耐受,LE細胞對TRAIL敏感。TRAIL作用后大約45%的LE細胞發(fā)生凋亡,而TRAIL作用后的LH細胞發(fā)生凋亡的比例很低。Western blot結果顯示,PP2A蛋白表達量在LH細胞與LE細胞間未見明顯差異,而PP2A的酶活性在LH細胞中明顯高于LE;c-Fos蛋白表達在LE細胞中明顯高于LH細胞。
結論:SV40ST賦予了良性永生化前列腺
4、上皮細胞LE細胞TRAIL敏感性表型。
第二部分:奧克代酸誘導TRAIL耐受的良性永生化前列腺上皮細胞LH細胞獲得TRAIL敏感表型的研究
目的:研究奧克代酸(Okadaic acid,OA)誘導TRAIL耐受的LH細胞獲得TRAIL敏感性及其機制。
方法:蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制劑OA處理TRAIL耐受的良性永生化前列腺上皮細胞LH細胞后,TRAIL作用于處理組和對照組,MTT法檢測細胞
5、活力,細胞形態(tài)學和流式細胞術染色檢測細胞凋亡狀態(tài)。Western blot檢測PP2A和c-Fos的蛋白表達。酶活性試劑盒檢測PP2A酶活性。用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析。
結果:顯示經OA誘導后的LH細胞對TRAIL敏感,細胞形態(tài)學可見大量的細胞發(fā)生凋亡,流式細胞檢測顯示經OA誘導TRAIL作用后的LH細胞有大約32%的細胞發(fā)生凋亡,而未經OA誘導TRAIL作用后的LH細胞中,凋亡細胞的比例很低。Western b
6、lot結果顯示,經OA誘導后LH細胞中PP2A蛋白表達量明顯減少,PP2A酶活性明顯下降,而c-Fos蛋白表達量經OA誘導后明顯增多。
結論:OA誘導TRAIL耐受的LH細胞獲得TRAIL敏感表型。
第三部分:A-Fos逆轉奧克代酸誘導TRAIL耐受的LH細胞向TRAIL敏感轉化的研究
目的:明確c-Fos在良性永生化前列腺上皮細胞對TRAIL敏感性中的作用及其機制。
方法:A-F
7、os質粒轉染LH細胞,奧克代酸(Okadaic acid,OA)處理后,TRAIL作用于各實驗組,MTT法檢測細胞活力,細胞形態(tài)學和流式細胞術檢測細胞凋亡狀態(tài)。Western blot檢測PP2A和c-Fos的蛋白表達。用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析。
結果:MTT法檢測細胞活力顯示,經OA誘導后的LH細胞對TRAIL敏感,轉染A-Fos質粒的LH細胞雖然經OA誘導但對TRAIL敏感性下降;流式細胞術顯示:未經OA誘導
8、TRAIL作用后的LH細胞中凋亡細胞的比例很低,經OA誘導TRAIL作用后的LH細胞后有大約51%的細胞發(fā)生凋亡;而經OA誘導TRAIL作用后,轉染A-Fos質粒的LH細胞的細胞凋亡率低于未轉染A-Fos質粒的LH細胞;Western blot結果顯示,經OA誘導后未轉染組和A-Fos轉染組中PP2A蛋白表達量明顯減少,而c-Fos蛋白表達量增多;且A-Fos轉染組中c-Fos蛋白表達量低于未轉染組。
結論:OA誘導TRA
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