CCN3促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲作用及可能機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高、死亡率高、預(yù)后差，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，而膠質(zhì)瘤的侵襲是臨床治療效果提高的重要障礙。因此，闡明其發(fā)病機(jī)理、尋找新的生物學(xué)標(biāo)記物及治療靶標(biāo)以提高治療效果已成為亟待解決的重大課題。腫瘤微環(huán)境是近年來(lái)腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的維持需要其所在的微環(huán)境提供支撐。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤間質(zhì)細(xì)胞創(chuàng)造的微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞自身通過(guò)旁分泌或自分泌創(chuàng)造的微環(huán)境，本課題將以低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172和

2、高惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87為研究模型，觀察分泌型蛋白CCN3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用并初步探討可能的分子機(jī)制。
　　方法:(1)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A172和U87細(xì)胞中CCN3的表達(dá)情況，同時(shí)用ELISA檢測(cè)A172和U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CCN3的蛋白含量;(2)用人CCN3重組蛋白刺激A172細(xì)胞，用MTS試驗(yàn)觀察細(xì)胞的增殖情況，Transwell試驗(yàn)觀察CCN3刺激前后A172細(xì)胞及U87細(xì)胞的侵襲能力;(3)用NF-κB

3、活性檢測(cè)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)CCN3刺激前后A172細(xì)胞及U87細(xì)胞中的NF-κB的活性，同時(shí)用western blot檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞中NF-κB上游調(diào)控者PI3K/Akt/IκBα的表達(dá)水平或活化狀態(tài);(4)應(yīng)用PI3K/Akt抑制劑LY294002單獨(dú)或與CCN3共同處理A172或U87細(xì)胞，觀察LY294002能否逆轉(zhuǎn)CCN3誘導(dǎo)的NF-κB活性增加和侵襲能力增強(qiáng)。
　　結(jié)果:(1) U87細(xì)胞中CCN3在mRNA的表達(dá)水平是A1

4、72細(xì)胞中的15.63倍，CCN3在A172細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的含量是48.62pg/ml，而在U87細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的含量是549pg/ml;(2) U87細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng)于A172細(xì)胞，10ng/ml的CCN3能明顯增強(qiáng)A172細(xì)胞的侵襲能力，而對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響;(3) U87細(xì)胞中NF-κB活性及PI3K和Akt的磷酸化水平高于A172細(xì)胞，而IκBα蛋白水平低于A172細(xì)胞，10ng/ml的CCN3能明顯上調(diào)A172細(xì)胞中

5、NF-κB的活性及PI3K和Akt的磷酸化水平，而下調(diào)IκBα的蛋白水平;(4) PI3K/Akt抑制劑LY294002能抑制U87細(xì)胞中NF-κB的活性，下調(diào)Akt磷酸化水平，上調(diào)IκBα蛋白水平，LY294002能抑制CCN3誘導(dǎo)的A172細(xì)胞中Akt磷酸化水平的上調(diào)和IκBα蛋白的下調(diào)，并且LY294002能抑制U87細(xì)胞及CCN3誘導(dǎo)的A172細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)論:(1)高惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CCN3的表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清