益氣養(yǎng)血化瘀法調(diào)控NK細(xì)胞活性逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本課題主要探討中醫(yī)藥益氣養(yǎng)血化瘀法通過調(diào)控NK細(xì)胞活性來逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化，為中醫(yī)藥益氣養(yǎng)血化瘀法逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化提供科學(xué)循證依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分：大鼠肝纖維化模型構(gòu)建。除正常雄性Wistar大鼠作為空白組，余大鼠40％CCL4橄欖油混合液皮下注射（5ml/kg,2次/周，共9周），6周處死6只大鼠取肝組織動(dòng)態(tài)觀察肝組織HE染色、Masson染色情況，造模9周處死6只大鼠采取鼠外周血用放射免疫法檢

2、測(cè)肝纖維化指標(biāo)（HA、LN），并取肝右葉組織進(jìn)行肝組織HE染色、Masson染色，并用免疫組化染色S-P法、平均光密度檢測(cè)肝組織α-SMA表達(dá)水平來結(jié)果確定造模成功。
　　第二部分：NK細(xì)胞與益氣養(yǎng)血化瘀法治療肝纖維化的相關(guān)性研究。確定大鼠肝纖維化造模成功后進(jìn)行分組，第10周停止造模并分為4組：扶正化瘀膠囊治療組、干擾素α-2b治療組、模型對(duì)照組、空白對(duì)照組，各組均12只大鼠并編號(hào)后予以藥物干預(yù)（扶正化瘀膠囊、干擾素α-2b），剩

3、余兩組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，治療8周后停止給藥禁食12小時(shí)。取股動(dòng)脈血檢驗(yàn)HA、LN；通過免疫組化的S-P法、平均光密度檢測(cè)肝組織中α-SMA表達(dá)及肝組織中NK細(xì)胞數(shù)量；從鼠抗凝血中分離NK細(xì)胞，并加入CD107a及CD56的抗體，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD107a/CD56陽(yáng)性率；并將鼠肝星形細(xì)胞（HSC-T6）與分離的Wistar鼠NK細(xì)胞孵育并加入PI、CFSE染色劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，用熒光顯微鏡定性觀察HSC-T6被殺傷情況及情況

4、及流式細(xì)胞標(biāo)記法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)HSC-T6的殺傷力。
　　結(jié)果：
　　第一部分：隨著造模時(shí)間增加，大鼠逐漸精神狀態(tài)及食欲稍變差，皮毛變黃，且局部皮毛有脫落；模型組大鼠肝臟邊緣變鈍，表面不光滑，局部稍有小結(jié)節(jié)樣改變；肝臟組織病理染色可見匯管區(qū)有大量膠原纖維沉積，膠原纖維向匯管區(qū)以外延伸，部分肝臟有厚薄不等的纖維間隔形成，分割包繞肝小葉。肝纖維化指標(biāo)（HA、LN）檢驗(yàn)結(jié)果顯示模型組較空白組含量增高（P＜0.05）；免疫組化S-P

5、法、平均光密度檢測(cè)α-SMA表達(dá)含量模型組較空白組明顯增高（P＜0.05）。
　　第二部分：扶正化瘀膠囊組及干擾素組的大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤較模型組大鼠有改善。肉眼觀察扶正化瘀膠囊組及干擾素α-2b組大鼠肝臟外觀無明顯差異，局部粗糙呈顆粒狀，無明顯結(jié)節(jié)隆起，邊緣變鈍，而模型組整個(gè)肝臟呈粗大小不等結(jié)節(jié)樣變化，肝臟質(zhì)地較硬，部分大鼠肝臟呈黃褐色樣變。肝纖維化指標(biāo)結(jié)果顯示扶正化瘀膠囊組、干擾素α-2b組大鼠外周血中的HA、LN含量水平相

6、當(dāng)，無明顯差異，但以上兩組大鼠外周血中的HA、LN均較模型組降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；通過免疫組化S-P法、平均光密度檢測(cè)到扶正化瘀膠囊組及干擾素α-2b組大鼠肝組織中α-SMA含量均較模型組含量降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；用同樣方法測(cè)得扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中的NK細(xì)胞數(shù)量與其它組水平相當(dāng)無明顯差異。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中NK細(xì)胞活性，結(jié)果顯示與干擾素治療組、模型對(duì)照組及正?？瞻捉M比較，扶正化瘀組的CD107