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1、干細(xì)胞是近幾年生命科學(xué)技術(shù)發(fā)展領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。自1999年以來(lái),干細(xì)胞的研究與應(yīng)用多次入選美國(guó)《Science》公布的年度世界十大科技成果。干細(xì)胞是一類未分化的細(xì)胞或原始細(xì)胞,是人體及各種組織細(xì)胞的最初來(lái)源,具有高度自我更新和多向分化潛能及可植入性、可重建性等特征。這些細(xì)胞可以通過細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的數(shù)量,又可以進(jìn)一步分化成為各種組織細(xì)胞,構(gòu)成機(jī)體各種復(fù)雜的組織器官,實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)部建構(gòu)和自我康復(fù)。目前根據(jù)干細(xì)胞的功能可將干細(xì)胞分為全能
2、干細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞,可以分化為機(jī)體所有組織細(xì)胞)、多能干細(xì)胞(具有多向分化潛能,可以分化為多種組織細(xì)胞,如骨髓造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等)和專能干細(xì)胞(維持某一特定組織細(xì)胞的單一方向自我更新,如腸上皮干細(xì)胞等)。也可根據(jù)干細(xì)胞的來(lái)源分為:來(lái)源于胚胎組織的干細(xì)胞--胚胎干細(xì)胞;來(lái)源于成人組織器官的干細(xì)胞--成體干細(xì)胞。根據(jù)表面抗原、轉(zhuǎn)移因子、蛋白質(zhì)表達(dá)等不同,也可將干細(xì)胞具體分類。由于受到倫理、取材等的限制,目前干細(xì)胞研究領(lǐng)域中最受重視
3、的是對(duì)骨髓中的干細(xì)胞的研究,近幾年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明骨髓干細(xì)胞是一群高度異質(zhì)的細(xì)胞群,包含多種類型的干細(xì)胞,因而骨髓干細(xì)胞在一定條件下可以分化形成多種造血外組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞和肝細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。通常把可以分化形成肝細(xì)胞的骨髓干細(xì)胞稱之為骨髓衍生肝干細(xì)胞,借此與其他來(lái)源的肝干細(xì)胞相區(qū)別。 目前發(fā)現(xiàn)有三種類型的細(xì)胞參與成體肝臟的更新與修復(fù),第一類是分化成熟肝細(xì)胞。在肝臟輕度受損時(shí),成熟肝細(xì)
4、胞經(jīng)過1~2次有絲分裂,使肝臟體積與功能得以恢復(fù),這種修復(fù)能力極為有限。第二類是來(lái)自終末小膽管Hering管的肝卵圓細(xì)胞。在肝臟嚴(yán)重受損時(shí),卵圓細(xì)胞大量增殖并分化為肝細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞,從而使肝臟修復(fù),這屬于短期增殖細(xì)胞,其修復(fù)能力有一定限度,它常需補(bǔ)充。第三類細(xì)胞是循環(huán)源于骨髓中的干細(xì)胞,其中的骨髓衍生肝干細(xì)胞,雖然它們數(shù)量非常少,但卻具有強(qiáng)大的自我更新能力,能夠不斷地釋放入血液循環(huán),最后至肝臟,并可以定向或橫向分化為肝細(xì)胞或肝臟前體
5、細(xì)胞。 慢性肝臟疾病以肝細(xì)胞變性、壞死、纖維化為主要病變,一旦肝纖維化形成,嚴(yán)重影響肝臟功能和患者的生活質(zhì)量。眾所周知,目前對(duì)于各種終末期肝病,促進(jìn)肝臟細(xì)胞再生和抗纖維化是治療肝臟疾病的關(guān)鍵。肝移植作為治療急、慢性肝衰竭的有效手段,但由于供肝缺乏、費(fèi)用昂貴、免疫排斥等問題,使其臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限,臨床上主要采取基礎(chǔ)療法和對(duì)癥治療。近年來(lái)干細(xì)胞技術(shù)的不斷突破及干細(xì)胞本身所具有的特性,尤其認(rèn)識(shí)到骨髓衍生肝細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞一樣強(qiáng)的分
6、化潛能,能分化形成肝細(xì)胞,為終末期肝臟疾病的治療提供了一條嶄新的途徑。這些骨髓源性肝干細(xì)胞還能有效地糾正細(xì)胞代謝缺陷,并且在一些動(dòng)物模型研究中顯示移植細(xì)胞具有明顯的存活優(yōu)勢(shì)。另外與其他干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞相比,骨髓源性干細(xì)胞更容易提取、分離、純化,能更好地解決肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)與擴(kuò)增問題。利用骨髓肝干細(xì)胞具有的強(qiáng)大增殖能力,采用細(xì)胞移植來(lái)修復(fù)與治療受損或病變的肝臟組織,將是一種理想的治療方法。 骨髓中含有大量不同類型和不同發(fā)育階段的
7、干細(xì)胞群,它們?cè)谛螒B(tài)上都表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞的單個(gè)核母細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞表面的標(biāo)志物和分化潛能,可進(jìn)一步把骨髓干細(xì)胞區(qū)分為不同的干細(xì)胞群,如:CD34+,c-kit+,Sca-1+,Thy-1+等干細(xì)胞系,均能在一定條件下分化形成肝細(xì)胞,但到底上述報(bào)道的特定標(biāo)記骨髓干細(xì)胞群中究竟哪種細(xì)胞群轉(zhuǎn)化為肝臟細(xì)胞效果最佳及潛力最大?我們從分選的骨髓Thy1.1+lin-,CD34+lin-,Sca-1+lin-,c-Kit+lin-四種干細(xì)胞群篩選并
8、證實(shí),骨髓中Lin-C-kit+干細(xì)胞群形成肝細(xì)胞的潛能最佳,是一群富含骨髓衍生肝干細(xì)胞的細(xì)胞群。 本實(shí)驗(yàn)利用四氯化碳(CCl4)以及酒精分別建立雌性小鼠的慢性肝損傷模型,分選出雄性小鼠骨髓c-Kitlin-細(xì)胞,并將其移植入模型小鼠體內(nèi),通過肝臟形態(tài)學(xué)、組織學(xué)變化及肝功能等指標(biāo)評(píng)價(jià)移植c-Kit+lin-細(xì)胞修復(fù)肝損傷的效果;利用小鼠的Y染色體性別決定區(qū)域DNA(Sry)和白蛋白的mRNA為標(biāo)記,通過原位雜交檢測(cè)受體肝臟中存在
9、的雙陽(yáng)性細(xì)胞及其數(shù)量,以此評(píng)價(jià)移植干細(xì)胞在肝內(nèi)歸巢、分布及分化情況,為將來(lái)臨床上應(yīng)用骨髓衍生肝干細(xì)胞肝內(nèi)移植治療肝疾病奠定基礎(chǔ)。 [材料和方法]: 1.模型小鼠的建立取6~8周齡的SPF級(jí)純系BALB/C雌性小鼠,質(zhì)量均為18-20g。 1.1四氯化碳性肝損傷每5天皮下注射40%四氯化碳(四氯化碳與花生油以4:6的體積比混合),4.5ml/kg,共16周。 1.2酒精性肝損傷給予54度白酒每天灌胃2次共1
10、6周,同時(shí)飲用10%(v/v)白酒飲料。第1周~第3周末灌胃量為每次8mL/kg,第4周~第7周末灌胃量為每次10mL/kg,第8周~第16周末灌胃量為每次12mL/kg。 2.小鼠骨髓C-Kit+lin-細(xì)胞分離和檢測(cè) 2.1免疫活性細(xì)胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)分離骨髓衍生肝干細(xì)胞取6~8周SPF級(jí)BALB/c雄系性小鼠,利用骨髓衍生肝干細(xì)胞抗原表面標(biāo)記,采用
11、MACS方法分離C-Kit+lin-細(xì)胞。 2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度。 先用PE標(biāo)記細(xì)胞群,將分離前細(xì)胞群和分離后細(xì)胞群進(jìn)行比較,可檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記在分選前后的純度情況及一抗和抗體磁珠結(jié)合情況。 3.同種同品系肝內(nèi)移植骨髓肝干細(xì)胞 3.1肝內(nèi)移植移植前,將分離好的供體雄性小鼠骨髓衍生肝干細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),離心8℃條件,10min,×1500rmp。棄上清,加入Buffer22.5ml重懸細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×
12、106個(gè)/ml,移植組每只予100μl細(xì)胞懸液尾靜脈注射。對(duì)照組僅予以注射Buffer2(PBS,PH7.2+0.5%BSA+2mMEDTA)100μl。 3.2細(xì)胞移植后的肝功能檢測(cè)分別于移植30天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組活殺小鼠取血清,測(cè)量血清中ALT、AST和ALB等肝功能指標(biāo)。 3.3肝組織常規(guī)病理檢查解剖小鼠完整取出肝臟組織,脫水,石蠟包埋,按標(biāo)準(zhǔn)操作行HE、VG染色,光鏡下觀察結(jié)果。 3.4原位雜交檢查切片防
13、脫RNA處理。設(shè)計(jì)制備并運(yùn)用小鼠Y染色體Sry基因的cDNA探針以及白蛋白mRNA探針,按原位雜交方法操作,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 在同一切片上先行白蛋白mRNA原位雜交,雜交后滴加Y染色體Sry基因的DNA探針。在熒光顯微鏡下激發(fā)各自波長(zhǎng),分別照相,并進(jìn)行圖象融合以獲得雙陽(yáng)性細(xì)胞圖像。 3.5骨髓衍生肝干細(xì)胞肝內(nèi)增殖情況比較每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,記錄雙陽(yáng)性細(xì)胞率。每組取8張切片計(jì)數(shù),了解移植細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)化情況。
14、 4.統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用-X±S表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)采用單向量方差分析(One-wayANOVA)、秩和檢驗(yàn)(Kruskal-WallisH)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independend-SamplesTTest)分析。P≤0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果]: 1.16周后酒精性肝損傷模型小鼠肝功能檢查提示ALT、AST升高,ALB下降,HE、VG染色病理切片可
15、見肝細(xì)胞變性、壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維增生等改變。 2.16周后四氯化碳性肝損傷模型小鼠肝功能檢查提示ALT、AST顯著升高,ALB降,HE、VG染色病理切片可見肝細(xì)胞片狀壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維大量增生等改變。 3.移植30天后移植c-Kit+lin-細(xì)胞組肝功能有明顯恢復(fù),指標(biāo)接近正常;對(duì)照組無(wú)明顯變化。 4.移植30天后,HE以及VG染色病理切片發(fā)現(xiàn)移植干細(xì)胞組肝組織少有肝纖維化,對(duì)照組肝臟纖維化較明顯
16、。 5.Y染色體Sry基因DNA以及白蛋白mRNA雙重原位雜交結(jié)果表明:移植組可見移植細(xì)胞在肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能的肝細(xì)胞。 [結(jié)論]: 1.皮下注射四氯化碳以及酒精灌胃可導(dǎo)致小鼠慢性肝損傷,于16周后可見肝臟存在纖維化的表現(xiàn)。 2.MACS分離c-Kit+lin-細(xì)胞純度均達(dá)到84%,回收率達(dá)到80%以上。 3.將小鼠骨髓c-Kit+lin-細(xì)胞移植后,可明顯改善肝損傷小鼠的肝功能,逆轉(zhuǎn)肝纖維化
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