乳腺癌雌激素受體細胞定位臨床病理意義的研究.pdf

1、背景:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響患者的健康及生存。尋找乳腺癌預后危險因素及潛在的治療靶點，是當前乳腺癌研究熱點之一。乳腺癌屬激素依賴性腫瘤，體內(nèi)雌激素水平是調控乳腺癌細胞增殖的重要因素，雌激素主要通過雌激素受體(Estrogen receptor，ER)發(fā)揮作用。雌激素與ER形成復合體后轉移至細胞核，作為一種轉錄因子，通過調節(jié)下游靶基因的轉錄發(fā)揮作用。這種機制稱為雌激素的基因組作用模式或核啟動的雌激素應答。但近年來研究已

2、經(jīng)證實，雌激素還存在非基因組作用模式，也稱為膜啟動的雌激素應答，在這種模式中，雌激素直接與分布在細胞膜/細胞質內(nèi)的雌激素結合蛋白結合，快速激活細胞內(nèi)信號傳導通路，主要包括ERK/MAPK信號通路、Ras-PI3K通路、JNK通路及第二信使系統(tǒng)等，使細胞產(chǎn)生快速反應，促進細胞發(fā)生增殖及惡性轉化。關于分布在癌細胞質/膜中的雌激素結合蛋白究竟為何種成分，目前尚無定論。
　　目前在臨床上廣泛使用免疫組化法檢測乳腺癌細胞的ER狀態(tài)，普遍認為

3、ERα蛋白定位于細胞核內(nèi)，而質/膜ERα由于其成分尚無定論，臨床意義不明，目前尚未引起廣泛關注。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，部分乳腺癌病例ERα免疫組化染色可見不同程度、不同比例的細胞質/膜著色，目前尚不清楚這些定位于細胞膜和/或細胞質中的蛋白究竟是何種成分以及這種蛋白具有何種臨床意義。我們推測該蛋白可能為ERα66的剪切變異體:ERα36。目前，該蛋白在乳腺癌發(fā)生、進展中的作用及其對相關治療藥物療效的影響及機制尚未明確。
　　目的

4、:1、研究ERα蛋白在人乳腺癌組織中的定位，確定是否存在細胞質/膜定位，探討細胞質/膜ERα表達的臨床病理意義及其對患者預后的影響。2、研究乳腺癌病例中質/膜ERα表達與ERα36表達及定位之間的關系，探討質/膜ERα究竟為何種蛋白。3、研究ERα36高表達后，MCF-7細胞系中ERα蛋白細胞內(nèi)定位情況以及HER-2、RARα、ki-67蛋白表達量的變化，探討ERα36促進乳腺癌細胞轉移可能的作用機制。
　　方法:1、免疫組化染色

5、法檢測ERα蛋白表達量及細胞內(nèi)定位，以＞1％腫瘤細胞出現(xiàn)確切的細胞核和/或細胞質/膜不同強度的黃色細顆粒狀著色計為ER核陽性或質/膜陽性。統(tǒng)計分析質/膜ERα蛋白與患者的月經(jīng)狀態(tài)、家族史、乳頭大導管受累、乳腺癌組織學分級、臨床分期、T分期、N分期、M分期、復發(fā)、HER-2表達等臨床病理特征之間的相關性。2、應用q-PCR方法檢測36例人乳腺癌新鮮標本中ERα36、ERα66mRNA表達量，分析二者與ERα核定位及質/膜定位的相關性;3、

6、應用核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取癌細胞的核蛋白和質/膜蛋白，得到高純度的核蛋白和質/膜蛋白，用Western-blot方法分別在核蛋白樣本及質/膜蛋白樣本中檢測ERα36和ERα66蛋白的表達情況，并對Western蛋白條帶掃描，進行灰度分析和計算，分析ERα36和ERα66在細胞內(nèi)的定位情況。4、構建pIRES2-EGFP-ERα36基因過表達載體，瞬時轉染至人乳腺癌細胞系MCF-7中，提取mRNA和蛋白質，分別應用q-PCR和

7、Western-blot方法鑒定ERα36和ERα66表達情況。5、收集轉染后MCF-7細胞，制作細胞蠟塊，免疫組化方法檢測ERα、HER-2及ki-67的表達。6、收集轉染后MCF-7細胞，提取總蛋白，Western-blot方法檢測HER-2、RARα蛋白表達。
　　結果:1、在1164個病例中， ERα免疫組化染色陽性定位主要位于細胞核，部分病例可觀察到細胞質/膜部位著色，質/膜著色可以與核著色同時出現(xiàn)（即核、質/膜均陽性）

8、，也可以單獨出現(xiàn)（質/膜陽性，核陰性）。ERα質/膜著色與較高的N分期、較高的HER-2評分及復發(fā)轉移有關，ERα質/膜陽性患者無進展生存期較短。2、36例樣本中共有18例（占50.0％）檢測到ERα66和/或ERα36 mRNA，其中10例檢測到ERα66mRNA，陽性百分比為27.8％;14例檢測到ERα36 mRNA，陽性百分比為38.9％。ERα66與ERα36共同表達的樣本共6例，占所有樣本的百分比為16.7％。ERα66 m

9、RNA陽性的病例均出現(xiàn)免疫組化核著色，ERα36mRNA陽性病例除1例以外免疫組化染色均出現(xiàn)ERα細胞質/膜著色。ERα66、ERα36 mRNA表達量分別與ERα免疫組化核定位及質膜定位有顯著的相關性(p＜0.05)。3、免疫組化ERα核及質/膜均陽性者Westernblot顯示ERα36和ERα66蛋白均有表達;ERα核陽性者多數(shù)為ERα66蛋白表達，少數(shù)為ERα36表達;ERα質/膜陽性者僅有ERα36蛋白表達;ERα核及質/膜均

10、陰性者ERα36和ERα66蛋白均未見表達。4、pIRES2-EGFP-ERα36真核表達載體成功轉染MCF-7細胞，轉染72小時后，轉染效率約為70％。qPCR檢測結果顯示，ERα36基因真核表達載體轉染MCF-7細胞后，ERα36基因過表達129.23倍;western-blot檢測到特異性ERα36條帶，兩種結果均證實轉染成功。5、轉染后MCF-7細胞ERα著色部位變化，除核表達之外，細胞質/膜中也可見陽性著色，進一步證實ERα3

11、6主要定位于細胞質或細胞膜;HER-2蛋白表達增加，部分腫瘤細胞胞膜出現(xiàn)陽性著色(1+～2+);ki-67指數(shù)增高。6、轉染72小時后，pIRES2-EGFP-ERα36與pIRES2-EGFP-NC相比，HER-2蛋白表達量增加，而RARα蛋白表達減少。
　　結論:1、人乳腺癌雌激素受體α(ERα)蛋白表達定位于癌細胞核和/或細胞質/膜中。質/膜ERα主要為ERα36，核ERα主要為ERα66，少部分為ERα36。2、乳腺癌細胞