TWIST抑制雌激素受體α表達(dá)的表觀遺傳分子機(jī)制及乳腺癌臨床意義.pdf

1、目的:探討與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子TWIST與雌激素受體α(ERα)之間分子水平和功能上的調(diào)控關(guān)系及其乳腺癌臨床的意義。
　　 方法:首先，構(gòu)建了pcDNA5-TWIST穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系;其次，為了鑒定出人類基因組中潛在的TWIST結(jié)合位點(diǎn)，用HEK293-TWIST細(xì)胞系和陰性對(duì)照的HEK293細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行ChIP測(cè)序分析;然后，為了檢驗(yàn)表達(dá)HEK293-TWIST的細(xì)胞中NuRD復(fù)合物的各組分是否也被募集到ESR1基因上的

2、TWIST結(jié)合部位，相繼作了ChIP和ChIP-re-ChIP實(shí)驗(yàn)分析;再次，為了確定乳腺癌細(xì)胞系中TWIST與ERα的表達(dá)關(guān)系，通過(guò)RT-PCR和Western blot方法，檢測(cè)了5個(gè)不同類型的乳腺癌細(xì)胞系中ESR1(ERα基因)的mRNA和蛋白質(zhì)水平;為了檢測(cè)與ESR1基因結(jié)合的TWIST/NuRD的相關(guān)區(qū)域是否具有抑制ESR1基因轉(zhuǎn)錄的功能，本課題完成了如下實(shí)驗(yàn):1、完成了熒光素報(bào)告基因分析技術(shù);2、為了檢測(cè)外源性TWIST的表

3、達(dá)是否抑制內(nèi)源性ERα的表達(dá)，本課題在乳腺癌細(xì)胞中做了TWIST的RNA干擾技術(shù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)技術(shù)，使TWIST基因沉默和過(guò)表達(dá)進(jìn)行分析;最后，為了檢測(cè)人類乳腺癌患者中TWIST與ERα表達(dá)的關(guān)系及可能的臨床意義，實(shí)驗(yàn)中收集了28例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的腫瘤組織，抽提mRNA，用半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了TWIST和ERα的mRNA和蛋白質(zhì)水平。
　　 結(jié)果:建立了HEK293-TWIST細(xì)胞系及其陰性對(duì)照的H

4、EK293細(xì)胞系;應(yīng)用該細(xì)胞系，進(jìn)行ChIP測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于人類ERα基因(ESR1)內(nèi)含子7上的與TWIST結(jié)合的關(guān)鍵DNA區(qū)域;再通過(guò)ChIP-re-ChIP實(shí)驗(yàn)，揭示了HEK293-TWIST細(xì)胞系中，在ESR1基因上的TWIST結(jié)合區(qū)域中，與TWIST結(jié)合的NuRD復(fù)合物重要組分Mi-2， MTA2和HDAC2均結(jié)合到人類ERα基因(ESR1)內(nèi)含子7上的關(guān)鍵DNA區(qū)域。這說(shuō)明了TWIST可以有效地將NuRD復(fù)合物募集到

5、ESR1基因上的TWIST結(jié)合區(qū)域;在高侵襲性的ERα表達(dá)陰性的SUM1315、MDA-MB-435和MDA-MB-231細(xì)胞系中，用RT-PCR和Western blot檢測(cè)出高水平的TWIST mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，而在低侵襲性且高表達(dá)ERα的T47D和MCF-7細(xì)胞系中沒有檢測(cè)出TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)水平。在熒光素報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn)中，將TWIST結(jié)合的關(guān)鍵DNA區(qū)域克隆到pGL3-Pro-Luc報(bào)告基因上而構(gòu)建成pGL3-3

6、32ESR1-Pro-Luc報(bào)告基因，再將pGL3-332ESR1-Pro-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒和TWIST表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的TWIST顯著地抑制了這個(gè)報(bào)告基因的活性，而對(duì)照組將pGL3-Pro-Luc和TWIST共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，TWIST的過(guò)表達(dá)并沒有抑制對(duì)照組中pGL3-Pro-Luc這個(gè)報(bào)告基因的熒光素酶活性。顯示ESR1基因上的TWIST/NuRD的相關(guān)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄抑制功能;在TWIST的RNA干擾

7、和細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，分析結(jié)果揭示了在MDA-MB-435和4T1細(xì)胞系中使TWIST基因沉默，ERα的mRNA表達(dá)提高了2.5-3倍;在T47D細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TWIST，抑制了ERα的mRNA和蛋白的表達(dá);在MCF-7細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TWIST，降低了細(xì)胞中的ERα的mRNA和蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明TWIST能抑制ERα的表達(dá);HDAC抑制劑—TSA，或者基因沉默TWIST均能夠解除TWIST對(duì)ERα的抑制作用。最后，我們收集28例侵襲性

8、乳腺癌組織進(jìn)行RT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有17位(61％)腫瘤患者具有TWIST的mRNA與蛋白高水平的表達(dá)而ERα的mRNA和蛋白低水平表達(dá)或無(wú)法檢測(cè)到，7位(25％)腫瘤患者具有TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)低水平表達(dá)或者無(wú)法檢測(cè)到而ERα的mRNA和蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高水平表達(dá)，2位(7％)腫瘤患者中TWIST和ERα的mRNA，蛋白質(zhì)水平都增高，另2位(7％)腫瘤患者TWIST和ERα的mRNA，蛋白質(zhì)水平都降低。這些結(jié)果顯示在86

9、％的侵襲性乳腺癌組織中，TWIST的表達(dá)與ERα表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:揭示了TWIST表觀遺傳學(xué)抑制ERα表達(dá)的分子機(jī)制;在TWIST表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中，TWIST通過(guò)招募NuRD復(fù)合物，從而抑制了ERα的表達(dá);TWIST表達(dá)與ERα的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān);ERα在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和抑制是一個(gè)可逆的過(guò)程。在這些ERα表達(dá)被抑制的乳腺癌細(xì)胞中我們使用HDAC抑制劑—TSA，或者基因沉默TWIST而重新恢復(fù)ERα表達(dá)，可望在