雌激素調(diào)節(jié)乳腺癌細胞P2X7受體的機制研究.pdf

1、雌激素是體內(nèi)一類重要的類固醇激素，不但對女性乳腺、卵巢、子宮等生殖器官的發(fā)育有重要影響，而且在心血管、內(nèi)分泌激素及骨骼系統(tǒng)中發(fā)揮作用。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。研究表明，體內(nèi)雌激素水平增高可增加乳腺癌的患病風險。絕經(jīng)期婦女中其乳腺癌患病率與體內(nèi)血液雌激素水平呈高度相關。雌激素在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子生物學機制是近年來研究的熱點，對防治乳腺癌及降低其復發(fā)率也有著重要的意義。
　　 雌激素發(fā)揮效應主要是通過經(jīng)典的雌激素

2、核受體來完成。即通過激活細胞內(nèi)核受體，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，因此又被稱為激素的基因組作用(Genomic Actions)。ERα和ERβ屬于經(jīng)典的依賴配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。雌激素與其結合后，通過雌激素反應元件(estrogen reactive elementERE)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時雌激素還可以與DNA上其他一些轉(zhuǎn)錄因子結合，從而募集其他共激活因子。ERα與ERβ因其結構不同，在腫瘤增殖過程中發(fā)揮不同的作用。

3、r>　　 近來研究發(fā)現(xiàn)激素還有生長因子樣的非核效應，又被稱為激素的非基因組作用(Non-Genomic Action)。G蛋白偶聯(lián)受體-30(G protein-coupled receptor30,GPR30)是一種新型膜受體。研究證實它可與雌激素特異性地結合，快速激活細胞內(nèi)EGFR-MAPK，ERK，P13K-AKT等信號通路，參與乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為，并且與乳腺癌的耐藥性有關。
　　 胞外核苷酸受體稱為P2受

4、體，包括P2X和P2Y兩個家族。P2Y家族是具有7次跨膜結構的G蛋白耦聯(lián)受體(含8個亞型)，P2X家族則屬配體門控非選擇性陽離子通道，是2次跨膜受體(含7個亞型)。P2X7受體廣泛存在于人體各種組織，并根據(jù)組織類型有不同分布，在乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中的表達明顯高于對應的正常組織。P2X7受體可誘導表皮細胞分化，引起巨噬細胞融合，刺激細胞因子的表達和釋放等，還可通過多條MAPK通路參與細胞的增殖、分化及凋亡。P2X7受體可

5、促進一些腫瘤細胞的增殖分化。其可能的機制為：P2X7受體可以提高細胞內(nèi)氧化磷酸化效率，增加ATP儲量。此外，有研究發(fā)現(xiàn)正常甲狀腺組織內(nèi)P2受體激活可導致IL-6釋放，而在某些內(nèi)分泌組織中，IL-6有促細胞增殖與分化作用。
　　 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)中P2X3mRNA及蛋白水平均升高，而雌激素替代療法可降低P2X3基因與蛋白水平的表達。雌激素通過調(diào)節(jié)初級感覺神經(jīng)元中P2X3受體，參與外周痛覺轉(zhuǎn)導通路，這種作用

6、可能是通過基因組效應完成的。在直結腸至炎大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中，雌激素可上調(diào).P2X3mRNA表達。這些均提示雌激素對P2X受體有調(diào)控作用。我們之前做了大量的工作，可以初步證明在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中，雌激素可上調(diào)P2X7受體的表達進而影響細胞的增殖。
　　 為進一步闡明雌激素調(diào)控P2X7受體可能的受體機制及信號轉(zhuǎn)導通路，故本實驗以雌激素受體ERα(+)、ERβ(+)、GPR30(+)的乳腺癌細胞MCF-7為模型，觀察雌激素通

7、過何種受體調(diào)節(jié)P2X7受體的表達從而影響細胞的增殖活力，以及其中可能的分子生物學機制。為臨床工作中雌激素依賴性腫瘤(卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌)的治療提供新的思路與理論依據(jù)。
　　 一、實驗材料和方法：
　　 (一)細胞增殖率的測定
　　 采用MTT法測定細胞增殖率。接種于96孔板上的細胞經(jīng)過藥物處理，每孔加15μlMTT繼續(xù)培養(yǎng)3-4hr，吸去培養(yǎng)基，各孔加入150μlDMSO，置于搖床上低速震蕩5min。酶標儀490

8、nm處波長測各孔吸光度。
　　 (二)RNA提取和Real-timePCR
　　 1、細胞總RNA提取和cDNA合成
　　 接種于12孔板中(1×105個/孔)的細胞經(jīng)藥物處理后，以Trizol提取液提取總RNA，采用紫外分光光度法測定RNA樣品純度(OD260/OD280)。同時進行RNA定量測定。提取的RNA中，每樣本取2μg在25μl體系中反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，用于實時定量聚合酶聯(lián)反應擴增P2X7

9、受體基因。
　　 2、Real-timePCR
　　 用于擴增P2X7受體的引物對為：Sense，AGATCGTGGAGAATGGAGTG；Antisense，TTCTCGTGGTGTAGTTGTGG。反應條件95℃5min，95℃30sec，58℃25秒，72℃30秒，40個循環(huán)。
　　 用于擴增β-actin的基因引物為Sense，GTGGGGCGCCCCAGGCACCA；Antisense，CTCCTTAA

10、TGTCACGCACGATTTC。反應條件95℃5min，95℃30sec，55.5℃25秒，72℃30秒，40個循環(huán)。
　　 (三)Western Blot
　　 種于6孔板的細胞經(jīng)藥物處理后，以預冷的RIPA緩沖液裂解標本，提取樣本蛋白。分光光度儀測定蛋白含量，各孔上樣量50～80mg蛋白，經(jīng)10％濃度的SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜。封閉，洗滌后分別加1:200稀釋的兔抗人抗體P2X7(70

11、kD)，1:500稀釋的兔抗人抗體ERα(66kD)，1:500稀釋的鼠抗人抗體ERB(56kD)，1:1000稀釋的兔抗人抗體AKT(60kD)，1:1000稀釋的兔抗人抗體ERK1/2(44/42kD)，1:8000稀釋的鼠抗人抗體β-actin(42kD)，4℃過夜。洗滌后，分別加入1:1000稀釋耦聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗兔抗體和羊抗鼠抗體，室溫孵育2hr后采用加強化學發(fā)光法(ECL)顯色。
　　 (四)siRNA(小干擾

12、RNA)：
　　 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明，用熒光標記的siRNA篩選最佳轉(zhuǎn)染條件和最佳目的siRNA。將含25nmol/LsiRNA及轉(zhuǎn)染試劑的無血清培養(yǎng)基混合均勻，轉(zhuǎn)染細胞。分別于18hr、24hr更換新鮮無激素培養(yǎng)基。經(jīng)不同藥物處理細胞后，采用MTT和westernblot等方法測定細胞增殖率或目的蛋白表達情況。
　　 二、實驗結果
　　 (一)雌激素通過ERα對乳腺癌MCF-7細胞的促增殖作用
　　 1

13、、雌激素及其拮抗劑對MCF-7細胞增殖活力的影響
　　 用17β-E2(0.1nmol/L-1μmol/L)處理MCF-7細胞48hr后，細胞的增殖活力均大于對照組的120％(各組P＜0.01)。ER拮抗劑ICI182，780可阻斷17β-E2對細胞的促增殖作用。
　　 2、ERα參與雌激素對MCF-7細胞增殖活力的影響
　　 雌激素受體ERα選擇性激動劑PPT(0.1nmol/L-10μmol/L)作用MCF-

14、7細胞48hr后，細胞的增殖活力均大于對照組的120％(各組P＜0.01)。ICI182，780可阻斷PPT對細胞的促增殖作用。共同以17β-E2和ERα拮抗劑MPP作用于細胞96hr后，MPP阻斷了17β-E2對細胞的促增殖作用。ERα表達降低也可阻斷17β-E2的促細胞增殖效應。
　　 3、ERβ不參與雌激素對MCF-7細胞增殖活力的影響
　　 ERβ拮抗劑PHTPP不能阻斷17β-E2對MCF-7細胞的促增殖效應。

15、ERβ表達降低不能阻斷17β-E2對MCF-7細胞增殖活力的促進作用。
　　 4、GPR30對MCF-7細胞增殖活力的影響
　　 MTT結果顯示，雌激素膜受體GPR30選擇性激動劑G-1不同濃度(0.1nmol/L-1μmol/L)作用于MCF-7細胞48hr后，細胞增殖活力無明顯改變。
　　 (二)P2X7受體參與雌激素對乳腺癌MCF-7細胞的促增殖作用
　　 1、P2X7受體激動劑或拮抗劑對雌激素促M

16、CF-7細胞增殖的影響
　　 MTT結果顯示，不同濃度P2X7受體激動劑BzATP(10μmol/L-1mmol/L)作用MCF-7細胞48hr后，細胞增殖活力均明顯增加。P2X7受體拮抗劑PPADS既能阻斷BzATP對細胞的促增殖效應，也能阻斷17β-E2對細胞促增殖效應。
　　 2、雌激素受體ERα對P2X7受體表達的影響
　　 Western blot結果顯示，不同濃度17β-E2(0.1nmol/L-0.

17、1μmol/L)作用MCF-7細胞24hr后，可上調(diào)P2X7受體的蛋白表達。
　　 實時定量RT-PCR和Westernblot結果顯示，單獨給予17β-E2(0.1μmol/L)處理MCF-7細胞后P2X7mRNA和蛋白表達量均明顯增加(P＜0.01)；ERα拮抗劑MPP(50μmol/L)阻斷了17β-E2對P2X7mRNA及蛋白表達的上調(diào)作用。
　　 單獨給予雌激素受體ERα選擇性激動劑PPT(0.1μmol/L)

18、處理MCF-7細胞后48hr后P2X7蛋白表達量明顯增加(P＜0.05)；雌激素受體ER拮抗劑ICI182，780能夠阻斷PPT對P2X7蛋白表達的上調(diào)作用。
　　 采用ERαsiRNA有效降低ERα表達后，給予17β-E2(0.1gμmol/L)作用于MCF-7細胞48hr，其P2X7蛋白表達水平與對照組相比無明顯與改變(P＞0.05)。
　　 3、雌激素受體ERβ對P2X7受體表達的影響
　　 共同以17β-

19、E2(0.1μmol/L)和PHTPP作用細胞，P2X7mRNA及蛋白表達量較單獨給予17β-E2組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 給予雌激素受體ERβ選擇性激動劑DPN(1nmol/L-10μmol/L)作用細胞48hr，P2X7蛋白表達無明顯改變。提示雌激素受體ERβ選擇性激動劑DPN不能上調(diào)MCF-7細胞中P2X7蛋白的表達。
　　 4、雌激素受體GPR30對P2X7受體表達的影響
　　 給予雌激素

20、受體GPR30選擇性激動劑G-1(1μmol/L)與GRP30選擇性拮抗劑G-15(1μmol/L)單獨或聯(lián)合作用細胞4hr，P2X7受體蛋白表達無明顯改變，提示GPR30不影響P2X7受體蛋白表達。
　　 (三)雌激素對MCF-7細胞P2X7受體調(diào)節(jié)作用的機制研究
　　 1、雌激素及ERα對ERK1/2蛋白磷酸化的影響
　　 單獨給予17β-E2(0.1μmol/L)或ERα選擇性激動劑PPT(0.1μmol/

21、L)處理MCF-7細胞15min和4hr，其p-ERK1/2蛋白表達量明顯升高，提示15min及4hr內(nèi)17β-E2或PPT均可上調(diào)細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平。且ICI182，780可阻斷17β-E2或PPT對細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的上調(diào)作用。
　　 2、雌激素及ERα對Akt蛋白磷酸化的影響
　　 以同樣方法處理細胞，結果提示15min和4hr內(nèi)17β-E2或PPT均可上調(diào)細胞內(nèi)磷酸化Akt的蛋白含量，且這一作

22、用可被ICl182，780阻斷。
　　 3、GPR30對ERK1/2及Akt蛋白磷酸化的影響
　　 GPR30選擇性激動劑G-1(1μmol/L)作用細胞后15min，4hr后，對細胞內(nèi)ERK1/2蛋白及Akt蛋白磷酸化有明顯促進作用。
　　 4、雌激素通過ERK1/2通路或AKT通路對P2X7蛋白的影響
　　 以U0126或LY294002與雌激素共同作用細胞，與單獨給予17β-E2組相比，P2X7蛋白

23、表達明顯降低(P＜0.05)。提示ERK1/2拮抗劑U0126或Akt拮抗劑LY294002可阻斷17β-E2對MCF-7細胞中P2X7的上調(diào)作用。
　　 三、結論
　　 1、雌激素通過激活ERα促進MCF-7細胞的增殖活力。
　　 2、雌激素通過ERα上調(diào)MCF-7細胞P2X7受體表達，進而促進MCF-7細胞的增殖。
　　 3、雌激素可能通過ERK1/2及AKT途徑上調(diào)P2X7受體的表達。