PELI1及IRAK1基因與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、本課題分為兩個部分，第一部分采用病例對照方式研究PELI1基因多態(tài)性與SLE的相關(guān)性，實時熒光定量PCR和Western blot技術(shù)觀察患者外周血PELI1基因mRNA和蛋白水平表達(dá)水平。第二部分研究IRAK1基因多態(tài)性與SLE的相關(guān)性，并通過熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸幋a區(qū)的陽性關(guān)聯(lián)SNP位點的生物學(xué)功能意義進(jìn)行初步的實驗研究。通過本研究，希望從遺傳學(xué)角度探討PELI1和IRAK1基因多態(tài)性與SLE易感性的關(guān)系，為SLE的臨床治療提供新

2、的線索。
　　研究一 PELI1基因與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:比較SLE患者和正常對照者PELI1基因的3個SNP位點(rs329497、rs329498和rs10496105)的基因型和等位基因分布頻率的差異，分析各個基因型和等位基因與SLE易感性的關(guān)系，構(gòu)建該基因3個SNP位點的單體型并分析與SLE的相關(guān)性，同時結(jié)合臨床資料，分析其與SLE腎臟損傷之間的關(guān)系。檢測SLE患者外周血單個核細(xì)胞(periphera

3、l blood mononuclear cell，PBMC)中的PELI1基因的mRNA和蛋白水平整體表達(dá)情況，為SLE發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物提供線索。
　　方法:1.基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析:收集兩所三甲醫(yī)院的SLE病例395名，患者均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College Rheumatology，ACR)修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)，合并其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者排除。正常對照組378名，各項體檢指標(biāo)均正常，不具備SLE診斷

4、標(biāo)準(zhǔn)中的任一項，無重大疾病史。提取所有樣本DNA，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)檢測PELI1基因的3個SNP位點（rs329497，rs329498和rs10496105）的基因型，采用x2檢驗和Logistic回歸分析比較各多態(tài)位點在SLE病例組與對照組間的基因型頻率及等位基因型頻率差異，進(jìn)行狼瘡性腎炎的分層分析。采用SASTM9.2和Haploview4.2軟件進(jìn)行計算兩兩位點間的連鎖不平衡并

5、構(gòu)建單體型，分析比較SLE病例組與對照組間的單體型頻率差異，進(jìn)行狼瘡性腎炎的分層分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.PBMC中的PELI1基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)檢測:實時熒光定量PCR技術(shù)檢測兩組PBMC中PELI1基因mRNA的表達(dá)量;免疫印跡法檢測Pellino1蛋白表達(dá)量。實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　結(jié)果:1.PELI1基因3個位點多態(tài)性與SLE易感性的關(guān)

6、系1) rs329497: SLE患者組基因型AA、AG、GG的頻率分別為6.0％、38.9％和55.1％，而對照組為9.6％、43.4％和47.1％。SLE患者組等位基因A和G的頻率為25.5％和74.5％，對照組為31.3％和68.8％。SLE患者組與對照組相比，rs329497位點基因型的頻率分布無顯著性差異(P＞0.05），兩組等位基因G的頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(G vs.A，Pcorrect=0.036, OR=1.33,9

7、5％ CI=1.06-1.67)。2) rs329498: SLE患者組基因型CC、AC和AA的頻率分別為8.4％、39.2％和52.4％，而對照組為10.6％、42.9％和46.6％。SLE患者組等位基因C和A的頻率為28.0％和72.0％，對照組為32.0％和68.0％。兩組間rs329498位點基因型頻率、等位基因頻率的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2.PELI1基因3個位點多態(tài)性與狼瘡腎的關(guān)系狼瘡腎組rs329497檢

8、出AA、AG、GG三種基因型的頻率分別為5.6％、42.4％和52.0％，而非狼瘡腎組則為5.8％、33.3％和60.8％;狼瘡腎組A和G等位基因頻率為26.7％和73.2％，非狼瘡腎組則為22.5％和77.5％。狼瘡腎組rs329498檢出CC、AC和AA三種基因型的頻率分別為6.5％、43％和50.5％，而非狼瘡腎組則為8.1％、34.1％和57.7％;狼瘡腎組C和A等位基因頻率為28.0％和72.0％，非狼瘡腎組則為25.2％和7

9、4.8％。狼瘡腎組rs10496105檢出AA、AG和GG三種基因型的頻率分別為2.0％、18.0％和80.0％，而非狼瘡腎組則為4.1％、17.1％和78.9％;狼瘡腎患者組A和G等位基因頻率為11.0％和89.0％，非狼瘡腎組則為12.6％和87.4％。
　　結(jié)論:rs329497的等位基因G可能是SLE發(fā)病的危險因素之一。單體型A-C-G是SLE的保護(hù)性單體型;G-A-G和G-C-G這兩種單體型是SLE的風(fēng)險單體型，這個危險

10、因素可能受到rs329497等位基因G的影響;PELI1基因多態(tài)性與SLE存在關(guān)聯(lián)性。
　　研究二 IRAK1基因與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:比較SLE患者和正常對照者IRAK1基因的6個SNP位點(rs1059702、rs1059703、rs3027898、rs7061789、rs5945174和rs2239673)的基因型和等位基因分布頻率的差異，分析各個基因型和等位基因與SLE易感性的關(guān)系，構(gòu)建該基因6個SN

11、P位點與SLE有關(guān)聯(lián)意義的單體型，同時結(jié)合臨床資料，分析其與SLE腎臟損傷之間的關(guān)系。并且利用熒光素酶報告基因初步探討外顯子區(qū)rs1059702、rs1059703位點多態(tài)性對Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響。
　　方法:1.基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析:收集兩所三甲醫(yī)院的SLE病例395名，正常對照組378名，提取所有樣本DNA，采用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測IRAK1基因的6個SNP位點(rs1059702、rs1059703、 rs3

12、027898、rs7061789、rs5945174和rs2239673)的基因型，采用x2檢驗和Logistic回歸分析比較各多態(tài)位點在SLE病例組與對照組間的基因型頻率及等位基因型頻率差異，進(jìn)行狼瘡性腎炎的分層分析。采用SASTM9.2和Haploview4.2軟件進(jìn)行計算兩兩位點間的連鎖不平衡并構(gòu)建單體型，分析比較SLE病例組與對照組間的單體型頻率差異，進(jìn)行狼瘡性腎炎的分層分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.熒光素酶報告

13、基因檢測:構(gòu)建四種不同載體pcDNA3-IRAK1-(587C+1595T)、pcDNA3-IRAK1-(587T+1595T)、 pcDNA3-IRAK1-(587C+1595C)和pcDNA3-IRAK1-(587T+1595C)，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞株，檢測Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性變化。實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　結(jié)果:1.IRAK1基因6個位點多態(tài)性與SLE易感性的

14、關(guān)系1)外顯子區(qū):①SLE患者組rs1059702檢出TT、CT和CC三種基因型的頻率分別為69.5％、26.9％和3.6％，對照組為58.2％、34.6％和7.2％。SLE患者組等位基因T和C的頻率為83.0％和17.0％，對照組為75.5％和24.5％。兩組間rs1059702基因型TT與CT+CC的頻率分布相比有顯著性差異，等位基因T的頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Tvs.C，Pcorrect=0.002，OR=1.58，95％CI=

15、1.23-2.03)。②SLE患者組rs1059703檢出CC、CT和TT三種基因型的頻率分別為71.0％、25.4％和3.6％，對照組為59.5％、33.1％和7.4％。SLE患者組等位基因C和T的頻率為83.7％和16.3％，對照組為76.1％和23.9％。兩組間rs1059703基因型CC與CT+TT的頻率分布相比有顯著性差異，等位基因C的頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2)3'UTR區(qū):SLE患者組rs3027898檢出CC、AC和A

16、A三種基因型的頻率分別為71.3％、25.4％和3.3％，對照組為61.9％、32.0％和6.1％。SLE患者組等位基因C和A的頻率為84.0％和16.0％，對照組為77.9％和22.1％。兩組間rs3027898位點基因型CC、AC和AA的頻率分布無顯著性差異（P＞0.05），等位基因C的頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.IRAK1基因6個位點多態(tài)性與狼瘡腎的關(guān)系1)外顯子區(qū):①狼瘡腎組rs1059702檢出TT、CT和CC三種基因型的頻

17、率分別為67.5％、29.5％和3.0％，非狼瘡腎組為69.7％、27.1％和3.3％。②狼瘡腎組rs1059703檢出CC、CT和TT三種基因型的頻率分別為69.8％、27.1％和3.0％，非狼瘡腎組為70.5％、26.2％和3.3％。2)3'UTR區(qū):狼瘡腎組rs3027898檢出CC、AC和AA三種基因型的頻率分別為69.8％、27.1％和3.0％，非狼瘡腎組為70.7％、26.8％和2.4％。
　　結(jié)論:IRAK1基因外顯

18、子區(qū)rs1059702位點基因型TT、rs1059703位點基因型CC是SLE的風(fēng)險基因型;3' UTR區(qū)rs3027898位點等位基因C、內(nèi)含子區(qū)rs7061789位點等位基因G、rs5945174位點等位基因G、rs2239673位點等位基因C可能是SLE的危險等位基因。IRAK1基因6個位點構(gòu)建的單體型中，C-A-A-T-T-A是SLE的保護(hù)性因素;包含了所有本研究發(fā)現(xiàn)的6個危險等位基因的單體型T-G-G-C-C-C是SLE的風(fēng)險