基于酵母微囊構(gòu)建新型口服巨噬細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：
　　口服給藥因其良好的安全性、便捷性與患者依從性是目前臨床使用最為廣泛的給藥方式。近年來，隨著納米技術(shù)、材料學(xué)及藥學(xué)等學(xué)科交叉研究的深入發(fā)展，現(xiàn)有的口服藥物遞送系統(tǒng)在腸道粘附釋放、腸道局部靶向釋放及腸道藥物轉(zhuǎn)運(yùn)等方面已取得了諸多的進(jìn)展，為大量難溶性藥物提供了較為理想的口服載體系統(tǒng)。此外，有關(guān)新型靶向藥物遞送系統(tǒng)的大量研究已清楚地表明靶向釋藥在提高藥物療效的同時(shí)，可顯著降低藥物的非靶效應(yīng)。與靜脈系統(tǒng)靶向藥物遞送系統(tǒng)的高速發(fā)展

2、相比，口服靶向藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展相對(duì)滯后。當(dāng)前研究的口服靶向遞送系統(tǒng)仍大多局限于以增加藥物生物利用度為目的的消化道靶向（如腸道粘附系統(tǒng)、pH響應(yīng)性結(jié)腸靶向遞送系統(tǒng)等）或淋巴系統(tǒng)靶向。由于口服后吸收轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的復(fù)雜環(huán)境，迄今為止，針對(duì)胃腸道以外病灶部位的口服靶向藥物遞送系統(tǒng)仍鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　為實(shí)現(xiàn)藥物的口服靶向遞送，本課題首次創(chuàng)新性基于仿生學(xué)原理，通過模仿微生物經(jīng)消化道系統(tǒng)性感染途徑，利用酵母微囊(Yeast shell，YS)表

3、面的β-1，3-D-葡聚糖構(gòu)建了新型口服巨噬細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，并基于炎癥及腫瘤部位的巨噬細(xì)胞募集作用成功實(shí)現(xiàn)了炎癥及腫瘤部位的口服靶向成像與藥物的靶向遞送。
　　方法：
　　1.酵母微囊的制備
　　2.正電荷納米粒/酵母微囊系統(tǒng)的制備與表征
　　3.酵母微囊對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的影響將小鼠源性巨噬細(xì)胞細(xì)胞株Raw264.7與酵母微囊按細(xì)胞與微囊個(gè)數(shù)比1∶50共孵育2h后，分別從巨噬細(xì)胞的吞噬與遷移兩個(gè)方面研究酵母

4、微囊對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。
　　4.口服酵母微囊的初步安全性評(píng)價(jià)
　　5.巨噬細(xì)胞對(duì)酵母微囊的識(shí)別作用研究
　　6.急性炎癥靶向熒光成像的研究
　　7.荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤靶向熒光成像研究
　　8.IONP YS在大鼠急性炎癥模型中的磁共振成像應(yīng)用
　　9.IONP YS在腫瘤磁共振成像中的應(yīng)用
　　10.難溶性小分子藥物-聚乙烯亞胺納米組裝體的制備與表征
　　11.納米自組裝體的體外抗

5、腫瘤活性
　　12.載藥酵母微囊的制備與表征
　　13.體外釋放實(shí)驗(yàn)
　　14.體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　15.體內(nèi)藥物分布實(shí)驗(yàn)
　　16.載藥酵母微囊的體內(nèi)抗炎療效評(píng)價(jià)
　　17.酵母微囊的體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)
　　18.酵母微囊的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究
　　結(jié)果：
　　1.基于酵母菌酸堿處理成功獲得了外壁主要由β-1，3-D-葡聚糖構(gòu)成的酵母微囊，其zeta電位為-6.5 mV左右，粒徑約為4

6、.5μm。并發(fā)現(xiàn)正電荷納米粒可基于與酵母微囊之間的靜電作用，首先富集于酵母微囊表面，隨后進(jìn)入酵母微囊內(nèi)部形成QDYS、IONP YS等正電荷納米粒/酵母微囊系統(tǒng)。
　　2.酵母微囊在5 g/Kg口服劑量下對(duì)小鼠并未表現(xiàn)出明顯的毒副作用或造成明顯的病理變化。
　　3.酵母微囊可基于Dectin-1受體被巨噬細(xì)胞快速識(shí)別并吞噬，其在巨噬細(xì)胞內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性，可在巨噬細(xì)胞吞噬后7天保持較為完整的酵母微囊形態(tài)。
　　4.QD

7、 YS經(jīng)口服給藥后可靶向分布至足趾腫脹部位或裸鼠腫瘤部位，能夠顯著提高足趾腫脹及腫瘤部位的熒光強(qiáng)度，具有良好的口服炎癥及腫瘤靶向性熒光成像效果。臟器及細(xì)胞水平的研究表明，QD YS在肝脾中具有較高的分布，其在肝、脾、足趾腫脹部位及腫瘤部位均特異性地分布于單核/巨噬細(xì)胞中。
　　5.IONP YS可口服靶向分布于足趾腫脹及腫瘤部位，YS負(fù)載提高了氧化鐵納米粒的T2弛豫作用，其效果與具有被動(dòng)靶向效應(yīng)的PEG-IONP無顯著性差異。

8、r>　　6.基于含羧基疏水小分子藥物與bPEI之間的多重非共價(jià)鍵作用力可成功制備粒徑大小在幾十納米至幾百納米之間，具有高效載藥性能與廣泛藥物適用性的正電荷納米組裝體。
　　7.正電荷納米組裝體表現(xiàn)出良好的體外生物學(xué)效應(yīng)。PTX/IND/bPEI25正電荷納米組裝體可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)PTX的攝取，顯著增強(qiáng)其體外抗腫瘤活性，具有明顯降低的IC50值，對(duì)于多藥耐藥細(xì)胞株有更為明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　8.通過酵母微囊與正電荷納米組裝體間的靜

9、電作用，可成功構(gòu)建酵母微囊載藥系統(tǒng)，如含IND的酵母微囊(IND YS)和含PTX的酵母微囊(PTX YS)等。該酵母微囊載藥系統(tǒng)可被巨噬細(xì)胞快速吞噬。
　　9.體外藥物釋放研究表明酵母微囊載藥系統(tǒng)可顯著提高難溶性藥物的體外釋放速率;體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)證明酵母微囊載藥系統(tǒng)能夠明顯增加IND的生物利用度，其藥時(shí)曲線下面積(AUC)為IND原料藥的4.5倍。
　　10.載藥酵母微囊的體內(nèi)組織與細(xì)胞水平的藥物分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IND YS口

10、服后可顯著提高IND在機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞中的分布，并依靠足趾腫脹部位巨噬細(xì)胞的募集作用，在該組織表現(xiàn)出靶向性的IND藥物分布特征。
　　11.IND YS在角叉菜膠介導(dǎo)的急性足趾腫脹模型與弗氏佐劑介導(dǎo)的慢性關(guān)節(jié)炎模型中具有比對(duì)應(yīng)IND/bPEI25納米組裝體更優(yōu)異的抗炎能力，并能明顯減輕IND對(duì)胃腸道的刺激。
　　12.基于B16F10荷瘤小鼠進(jìn)行的口服抗腫瘤活性評(píng)價(jià)表明，PTX YS口服給藥后有明顯的腫瘤靶向效應(yīng)，連續(xù)給藥

11、2周后其在腫瘤部位的PTX濃度可達(dá)到PTX注射液的7.8倍，并表現(xiàn)出優(yōu)異的腫瘤抑制作用。
　　13.通過活體成像、體視熒光顯微鏡及CLSM進(jìn)行的酵母微囊口服吸收途徑的研究發(fā)現(xiàn)，QD YS主要粘附與吸收部位為回腸段的集合淋巴濾泡，進(jìn)一步的免疫熒光染色表明QD YS在集合淋巴濾泡主要分布于M細(xì)胞與固有層的單核/巨噬細(xì)胞中。
　　14.脾切除可顯著減少Q(mào)D YS在足趾腫脹部位及單核/巨噬細(xì)胞中的分布。此外，健康小鼠在口服QD YS

12、后，QD在脾臟巨噬細(xì)胞的分布與足趾腫脹小鼠相似，但在肝臟巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及足趾巨噬細(xì)胞中的分布卻顯著下降。
　　15.口服及靜脈注射昆布多糖均可顯著抑制QD YS在足趾腫脹部位及單核/巨噬細(xì)胞中的分布?？诜ゲ级嗵强梢种颇c道集合淋巴濾泡對(duì)QD YS的吸收。
　　結(jié)論：
　　1.成功制備了外壁主要由β-1，3-D-葡聚糖構(gòu)成的酵母微囊，基于靜電作用，可將表面正電荷納米粒或納米組裝體高效負(fù)載于其中;通過Dectin

13、-1受體，酵母微囊負(fù)載系統(tǒng)可被巨噬細(xì)胞特異性識(shí)別并吞噬。
　　2.酵母微囊經(jīng)口服后可靶向遞送至腫瘤及炎癥部位的單核/巨噬細(xì)胞，通過炎癥及腫瘤部位的單核/巨噬細(xì)胞募集作用，實(shí)現(xiàn)炎癥與腫瘤部位的靶向成像，在細(xì)胞介導(dǎo)的靶向成像中具有良好的應(yīng)用前景。
　　3.通過含羧基疏水小分子藥物與聚乙烯亞胺之間的多重非共價(jià)鍵作用力可成功構(gòu)建載有難溶性藥物的正電荷納米組裝體;該類正電荷納米組裝體可自發(fā)沉積于酵母微囊內(nèi)，獲得具有較高載藥性能的酵母微

14、囊載藥系統(tǒng)。
　　4.通過炎癥及腫瘤部位的單核/巨噬細(xì)胞募集作用，酵母微囊載藥系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)炎癥與腫瘤部位的靶向藥物遞送，從而提高所負(fù)載藥物的體內(nèi)抗炎與抗腫瘤活性。
　　5.酵母微囊口服后吸收的主要途徑為經(jīng)腸道集合淋巴濾泡M細(xì)胞表面的Dectin-1受體識(shí)別進(jìn)入腸壁固有層，被其中的單核/巨噬細(xì)胞攝取并遷移至腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)，隨后分布至淋巴循環(huán)內(nèi)，在最大的淋巴組織脾臟中廣泛分布于其單核/巨噬細(xì)胞中，并通過脾臟在炎癥狀態(tài)下對(duì)炎癥部位單

15、核/巨噬細(xì)胞的補(bǔ)充與遷移，最終將酵母微囊轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血、臟器及炎癥部位單核/巨噬細(xì)胞中。
　　總之，本課題基于對(duì)微生物經(jīng)胃腸道感染途徑的認(rèn)識(shí)，通過仿生學(xué)原理設(shè)計(jì)并構(gòu)建了酵母微囊口服巨噬細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，并可基于炎癥及腫瘤部位的巨噬細(xì)胞募集作用，實(shí)現(xiàn)炎癥及腫瘤部位的靶向成像與藥物的靶向遞送。該載藥系統(tǒng)制備方法簡(jiǎn)單高效，適用藥物廣泛，易于規(guī)?；苽洌虼司哂辛己玫膽?yīng)用前景。此外，該系統(tǒng)有望為口服炎癥及腫瘤靶向藥物遞送的研究提供一種新的思