新型光響應性核酸遞送系統(tǒng)及其在siRNA遞送中的應用研究.pdf

1、相較于病毒載體，陽離子非病毒載體由于其安全性高，易于修飾及成本低廉等優(yōu)勢受到人們青睞。然而由于溶酶體逃逸困難導致轉(zhuǎn)染效率較低是限制陽離子型非病毒載體在臨床上應用的主要原因之一。通過光化學試劑幫助藥物從溶酶體中逃逸的技術被稱為光化學轉(zhuǎn)染(PCI)。利用短時間內(nèi)能夠產(chǎn)生大量活性氧(ROS)的光敏劑，在光照條件下，可以達到破壞溶酶體膜，在保護其它細胞器完整的條件下將藥物釋放的目的。C60由于其光化學特性及可修飾性強等特點，可以作為傳統(tǒng)光敏劑的

2、替代物，對其進行修飾后依據(jù)PCI機制幫助載體實現(xiàn)溶酶體逃逸。本研究以此為出發(fā)點，分別構建了陽離子化富勒烯-葡聚糖(C60-Dex-NH2)作為核酸載體以及陰離子化富勒烯-葡聚糖(C60-Dex-COOH)作為作為陰離子包覆材料。研究水溶性富勒烯通過體外光照，幫助復合物從溶酶體中逃逸，在體內(nèi)及體外實驗中對干擾效率的影響。
　　在保證復合物安全性的前提下，有效提高載體從內(nèi)涵體和溶酶體中的逃逸效率，我們制備了一種新型的核酸載體(C60-

3、Dex-NH2)。這種新型載體以水溶性多糖為骨架，以C60作為疏水性中心及光敏基團。該載體系統(tǒng)可以利用簡單的體外的LED燈光照引發(fā)C60的光化學反應，通過產(chǎn)生的活性氧破壞內(nèi)體膜，達到促進核酸復合體從內(nèi)體及溶酶體中釋放的效果。材料學檢測中，用TNBS/elemental analysis，GPC和SSNMR(13C，HPDEC)對C60-Dex-NH2載體中氨基轉(zhuǎn)化率，分子量，化學結構進行表征;凝膠電泳結合DLS/ELS對C60-Dex-

4、NH2結合siRNA的能力及C60-Dex-NH2/siRNA復合物的粒徑及表面電位進行表征;細胞色素C檢測C60-Dex-NH2/siRNA復合物在光照條件下ROS產(chǎn)生情況。生物學檢測中用cck-8檢測復合物對MDA-MB-231細胞毒性;流式結合confocal檢測復合物進入內(nèi)涵體及溶酶體并逃逸的過程及對MDA-MB-231-EGFP細胞的干擾效率;體內(nèi)實驗中，通過活體成像及取腫瘤勻漿的方式檢測C60-Dex-NH2/siRNA對4

5、T1-GFP-LUC2荷瘤小鼠的干擾效率。實驗結果表明，在光照條件下，C60-Dex-NH2/siRNA復合物能夠持續(xù)的產(chǎn)生活性氧ROS，破壞溶酶體膜，幫助復合物從溶酶體中逃逸。在體內(nèi)試驗中光照組對MDA-MB-231-EGFP細胞干擾效率達到53.02％，在體外實驗中對4T1-GFP-Luc2荷瘤小鼠高劑量光照組干擾效率能夠達到69.05％。
　　為了進一步驗證在不同體系中水溶性C60均能夠起到光敏劑的作用，以及探究陰離子包覆層

6、對陽離子化高分子載體在血清環(huán)境中抑制血清蛋白吸附的作用。我們設計合成了羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修飾富勒烯(C60-Dex-COOH)兩種陰離子化高分子，將其包覆精胺化普魯蘭與siRNA形成的復合物(PS/siRNA)外部，以減少復合物對血清蛋白的吸附。通過DLS/ELS檢測陰離子包覆前后復合物的顆粒粒徑及Zeta電位;用QCM-D驗證陰離子包覆層的形成并評價其對牛血清白蛋白(BSA)吸附量的影響;使用cck-8試劑

7、、流式細胞術檢測包覆前后及不同包覆比例下復合物的細胞毒性、進入細胞的情況及對Hela-EGFP細胞的干擾效率。結果表明，Dex-COOH與C60-Dex-COOH能夠在PS/siRNA外部形成穩(wěn)定的負電性包覆層，有效阻止BSA的吸附，并在無血清的條件下顯著降低復合物的細胞毒性;在有血清環(huán)境中，表面包覆了陰離子化高分子的復合物可以不受血清蛋白的影響而被細胞大量攝取。對包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA復合物轉(zhuǎn)染組施加光照，可