基于順鉑-酵母微囊的口服靶向遞送系統(tǒng)在治療腫瘤中的應(yīng)用研究.pdf

1、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ)，CDDP)于1978年首次被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration， FDA)批準(zhǔn)用于治療睪丸癌和膀胱癌，之后在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，作為一種廣譜抗腫瘤藥物，順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制是通過與腫瘤細(xì)胞DNA形成復(fù)合物，干擾細(xì)胞的生長周期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。在多種實(shí)體瘤的化療過程中有顯著的效果，包括乳腺癌、卵巢癌、腸癌、肺癌、

2、腦癌等惡性腫瘤。通常情況，在順鉑治療腫瘤的初期，腫瘤生長會得到明顯的抑制甚至表現(xiàn)出實(shí)體瘤明顯減小的治療效果，在初期治療中病人的病情也表現(xiàn)得較為穩(wěn)定。但是，隨著治療的繼續(xù)，最終會有很多病人對順鉑療法產(chǎn)生耐藥性（尤其在結(jié)直腸癌、肺癌和前列腺癌患者身上表現(xiàn)更為明顯）。并且，有很大一部分最初呈順鉑敏感性的腫瘤最終都會發(fā)展出藥物抗性（這種現(xiàn)象多發(fā)生在卵巢癌患者身上）。此外，臨床使用順鉑作為治療藥物時(shí)會采用靜脈注射給藥，避光2小時(shí)內(nèi)滴完，由于順鉑具

3、有不可忽略的腎毒性，給藥劑量較大時(shí)(80-120 mg/m2)須同時(shí)進(jìn)行水化和利尿，病人需要長期住院治療。耐藥性和腎毒性很大程度的限制了順鉑在腫瘤治療中的應(yīng)用，因此在順鉑之后的研究中的主要策略集中在兩個(gè)方面:逆轉(zhuǎn)耐藥性和降低腎毒性。
　　口服給藥途徑相對于其他給藥途徑具有良好的患者依從性及安全性，是目前應(yīng)用最為廣泛的給藥途徑，臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示約有80％的藥物在應(yīng)用中選擇口服給藥途徑。本課題組和其他實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，酵母真菌等微生

4、物可經(jīng)胃腸道感染大量分布于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，因此我們設(shè)想可以通過腫瘤部位的單核/巨噬細(xì)胞募集效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的抗腫瘤藥物的靶向遞送。
　　目的：本研究提出構(gòu)建順鉑/酵母微囊(PreCDDP/YC)的口服靶向藥物遞送系統(tǒng)。首先合成帶氨基的順鉑前藥和酵母微囊(Yeast capsule，YC)，再通過兩者之間靜電作用形成遞送系統(tǒng);然后評價(jià)其安全性以及體內(nèi)外的抗腫瘤效果;旨在實(shí)現(xiàn)順鉑衍生藥物的口服抗腫瘤效果，以此降低靜脈滴注的副作用，提高患

5、者依從性使之無需長期住院就能輕松實(shí)現(xiàn)口服藥物化療的治療過程。
　　方法:
　　1.酵母微囊的制備
　　稱取一定重量的食用酵母，分別經(jīng)過NaOH溶液和HCl溶液處理，然后用異丙醇和丙酮除去可溶組分，室溫真空干燥后即得YC。
　　2.酵母微囊最佳制備條件的研究
　　為了使制備得到的酵母微囊具有最大的負(fù)載能力，我們對制備過程中的酸堿處理時(shí)間對YC包埋效率的影響進(jìn)行了研究，在除核步驟中，首先固定堿處理時(shí)間不變，改變

6、酸處理時(shí)間即可得到最佳酸處理時(shí)間;然后再固定酸處理時(shí)間不變，改變堿處理時(shí)間即可得到最佳堿處理時(shí)間。
　　3.順鉑前藥的制備
　　稱取一定量的CDDP原料藥分散在水中成混懸液，加入硝酸銀晶體，一定條件下過夜反應(yīng)后得到的藥物溶液真空冷凍干燥即得順鉑前藥物(PreCDDP)-cis-[Pt(NH3)2(H2O)2](NO3)2的凍干樣品。
　　4.順鉑/酵母微囊口服靶向遞送系統(tǒng)的制備和表征
　　稱取一定質(zhì)量的YC，分散

7、在水中形成混懸液，然后放置在37℃恒溫孵箱中孵育;稱取一定質(zhì)量的PreCDDP凍干樣品，在水中混懸并超聲至完全溶解。將孵育過的YC混懸液同PreCDDP溶液混合，37℃油浴孵育，得到的溶液離心后去掉上清液，沉淀在室溫下真空干燥即得PreCDDP/YC，然后透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)。之后我們同樣對PreCDDP/YC最佳制備條件進(jìn)行了研究。
　　5.藥物遞送系統(tǒng)的體外釋放實(shí)驗(yàn)
　　將制備好的PreCDDP/

8、YC混懸pH1.2的HCl溶液和pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，模擬藥物口服后在胃腸道中的釋放過程，得到的不同時(shí)間點(diǎn)的釋放樣品，樣品中的鉑原子濃度采用原子吸收光譜法(Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)測定，通過計(jì)算藥物的累積釋放百分率，繪制相應(yīng)的藥物釋放曲線。
　　6.藥物遞送系統(tǒng)對巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的影響
　　將濃度梯度的PRECDDP溶液與小鼠源性巨噬細(xì)胞細(xì)胞株Raw264.7共同孵育，研

9、究PreCDDP/YC對巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。
　　7.藥物遞送系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性
　　復(fù)蘇并培養(yǎng)人源性乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR，人源性肝癌細(xì)胞HepG2，人源性宮頸癌細(xì)胞Hela，人源性肺癌細(xì)胞A549等腫瘤細(xì)胞株，然后將其和不同劑量的PreCDDP/YC共孵育24 h和48 h，加入CCK8試劑，用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞吸光度然后計(jì)算存活率。
　　8.藥物遞送系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性
　　A

10、549細(xì)胞經(jīng)裸鼠左側(cè)腋下皮下接種，待腫瘤體積大小2 cm3時(shí)，口服給予不同劑量的PreCDDP/YC混懸液，評價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤活性，并于CDDP靜脈注射組荷瘤裸鼠比較;裸鼠經(jīng)過治療處死后取其血液，心、肝、脾、肺、腎及腫瘤，計(jì)算臟器指數(shù)，測定血常規(guī)和肝腎功各項(xiàng)指標(biāo)水平的變化。
　　9.藥物遞送系統(tǒng)的安全性評價(jià)
　　30只雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組，分別給予生理鹽水灌胃，PreCDDP/YC高劑量灌胃，PreCDDP/YC低

11、劑量灌胃，CDDP原料藥灌胃組以及CDDP靜脈注射，五次給藥后通過小鼠體重變化對比毒性。
　　結(jié)果:
　　1.食用酵母菌經(jīng)過酸堿處理后成功獲得了外壁主要由β-1，3-D-葡聚糖構(gòu)成的酵母微囊，粒徑較為均勻的分布在2.5-3μm，Zeta電位約為-10 mV。酵母微囊的形態(tài)學(xué)表征結(jié)果也表明大部分的酵母真菌細(xì)胞內(nèi)容物已被除去。
　　2.通過對酵母微囊制備最佳條件的研究，我們得出經(jīng)過堿處理1.5h、酸處理0.5 h之后，酵母

12、微囊負(fù)載正電荷納米粒性能最高。
　　3.PreCDDP與YC在共孵育的過程中通過靜電作用成功構(gòu)成了PreCDDP/YC系統(tǒng)，我們對其最佳制備條件的研究表明共孵育時(shí)間為1h、PreCDDP選取pH7的超純水作為溶劑時(shí)YC對PreCDDP的包封率較好且不影響到藥物的性質(zhì)。PreCDDP/YC的形態(tài)學(xué)表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明包藥后的YC內(nèi)容物明顯增多，細(xì)胞形態(tài)更加豐滿且表面可見明顯且均勻的凹凸。
　　4.體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明PreCDDP

13、/YC可在胃腸道環(huán)境下緩慢均勻的釋放，并且具有較好的穩(wěn)定性。
　　5.PreCDDP/YC遞送系統(tǒng)對巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性無顯著性影響。
　　6.體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明PreCDDP/YC對幾種不同種類的腫瘤細(xì)胞具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒性，可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
　　7.為研究PreCDDP/YC的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，我們給無胸腺裸鼠注射A549細(xì)胞，成功建立了A549肺癌移植瘤裸鼠模型，然后對荷瘤小鼠進(jìn)行隨機(jī)分

14、組，采用不同治療方案進(jìn)行治療，經(jīng)過一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)PreCDDP/YC口服和CDDP靜脈注射均能對腫瘤的生長起到抑制作用，其中PreCDDP/YC的治療效果呈劑量依賴性，但PreCDDP/YC口服治療腫瘤過程中不會造成順鉑所造成的小鼠體重明顯下降，并且也不會影響血液中各因子的含量以及小鼠的肝功能、腎功能。此外活體成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明酵母微囊靶向集中在腫瘤部位，在治療中有助于提高腫瘤局部藥物濃度起到更好的抗腫瘤作用。
　　8.相比臨床

15、上采用的順鉑的給藥方式，PreCDDP/YC對小鼠的體重?zé)o影響，對其臟器指數(shù)，肝腎功和血常規(guī)指標(biāo)也沒有造成顯著性的影響，HE染色切片也證明了PreCDDP/YC口服給藥對小鼠臟器未造成損傷，具有較好的安全性。
　　結(jié)論:
　　1.成功制備對正電荷納米粒有較好負(fù)載性的酵母微囊，基于靜電作用，可將制備的帶正電荷的順鉑前藥高效負(fù)載于其中，通過腫瘤部位的單核/巨噬募集效應(yīng)，酵母微囊負(fù)載系統(tǒng)可靶向聚集于腫瘤部位并被巨噬細(xì)胞吞噬達(dá)到治療

16、作用。
　　2.PreCDDP/YC口服藥物遞送系統(tǒng)具有較好的安全性，在腫瘤治療中，相對于傳統(tǒng)的CDDP靜脈注射治療方案，PreCDDP/YC能夠靶向治療腫瘤效果的同時(shí)又減輕了CDDP的毒副作用。
　　總之，本課題基于一些真菌等微生物可經(jīng)過胃腸道感染體內(nèi)大量分布的巨噬細(xì)胞的途徑的認(rèn)識，構(gòu)建了順鉑/酵母微囊口服藥物遞送系統(tǒng)。傳統(tǒng)的鉑類藥物通常以靜脈注射方式進(jìn)行治療，我們首先對順鉑分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一定程度的改造，使之形成帶有正電荷