多種谷物豆組合膳食纖維的特性及其對細(xì)胞糖代謝的作用.pdf

1、目的:
　　(1)分別提取多種谷物豆組合（簡稱谷豆組合）與全小麥（簡稱小麥）中的膳食纖維和類黃酮，掌握其含量、理化和體外抗氧化特性的差異;
　　(2)熟悉谷豆組合與小麥中膳食纖維和類黃酮對Caco-2細(xì)胞模型和酶-抑制劑模型上α-葡萄糖苷酶活性、對腸葡萄糖轉(zhuǎn)運起關(guān)鍵作用的Na+-K+-ATP酶活性、對腸葡萄糖轉(zhuǎn)運、葡萄糖生成中α-葡萄糖苷酶S-I以及腸葡萄糖轉(zhuǎn)運載體SGLT1、GLUT2的基因和蛋白的調(diào)控水平的影響;

2、　　(3)了解谷豆組合與小麥中膳食纖維和類黃酮對胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的影響，來源不同的膳食纖維、類黃酮對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用及差異，對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型肝糖原合成、己糖激酶(HK)活力、丙酮酸激酶(PK)活力的改善作用，以及對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝過程中AMPKα、AKT蛋白磷酸化水平、IRS-1蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法:
　　(1)用酶-化學(xué)法提取谷豆組合與小麥中膳

3、食纖維，按國標(biāo)法測定其含量，用浸提回流法提取谷豆組合與小麥中類黃酮，用可見光分光光度法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對照，測定其含量;按國標(biāo)法測定谷豆組合與小麥中膳食纖維膨脹率、持水力、葡萄糖透析延遲指數(shù)，并通過DPPH自由基清除率和總抗氧化能力(T-AOC)法測定其體外抗氧化能力;
　　(2)用葡萄糖測定試劑盒測定并計算各組對Caco-2細(xì)胞模型和酶-抑制劑模型上α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，同時用ELISA法測得其對Na+-K+-ATP酶活

4、性的影響，用葡萄糖測定試劑盒測定并計算其對葡萄糖轉(zhuǎn)運的抑制作用，最后運用Real-time PCR法測定S-I、SGLT1、GLUT2mRNA的表達(dá)，運用Western blotting法測定S-I、SGLT1、GLUT2蛋白水平的表達(dá)對其機(jī)制進(jìn)行探討;
　　(3)用胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，通過葡萄糖消耗量的測定，確定建立體外胰島素抵抗模型的最佳時間和最佳濃度及其穩(wěn)定性的檢測;
　　(4)用葡萄糖測定試劑

5、盒測得并計算各組在胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的含量以及用MTT法測干預(yù)物對IR-HepG2細(xì)胞活性的影響，用總蛋白定量試劑盒、肝糖元、丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)分別測定干預(yù)物對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞肝糖元合成、PK活力、HK活力的影響，最后運用Western blotting法測定對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝過程中AMPKα、AKT蛋白磷酸化水平以及IRS-1蛋白水平的影響其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　結(jié)果:

6、>　　(1)谷豆組合與小麥中膳食纖維和類黃酮的理化和抗氧化特性檢測結(jié)果表明，谷豆組合的膨脹力、持水力，葡萄糖透析延遲能力，體外抗氧化能力均優(yōu)于小麥;
　　(2)谷豆組合與小麥中膳食纖維和類黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用在60 min達(dá)到最大抑制作用，且濃度均為100μg/mL時，在Caco-2細(xì)胞模型上，抑制率從大到小為谷豆組合膳食纖維、小麥膳食纖維、谷豆組合類黃酮、小麥類黃酮;在酶-抑制劑模型上，抑制率從大到小為谷豆組合膳食纖維、

7、小麥膳食纖維、谷豆組合類黃酮、小麥類黃酮;四種干預(yù)物均不影響Na+-K+-ATP酶活性;
　　在30、60、90、120 min四個時間點，對葡萄糖轉(zhuǎn)運的抑制最佳濃度為100μg/mL，谷豆組合膳食纖維的抑制作用優(yōu)于其它三組;谷豆組合膳食纖維、小麥膳食纖維、谷豆組合類黃酮、小麥類黃酮均有抑制S-I、SGLT1、GLUT2 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的作用，且谷豆組合作用優(yōu)于小麥。
　　(3)在胰島素濃度為10-8 mol/L

8、，作用時間為36 h，饑餓12h為誘導(dǎo)胰島素抵抗模型建立的最佳條件，并且在48 h內(nèi)穩(wěn)定;與模型組比，濃度為100μg/mL時，谷豆組合與小麥中膳食纖維可以明顯增加葡萄糖的消耗量，在濃度為100μg/mL時進(jìn)行組間比較，提高IR-HepG2細(xì)胞肝糖元含量、HK、PK活力的能力從大到小為谷豆組合膳食纖維、小麥膳食纖維、谷豆組合類黃酮、小麥類黃酮;谷豆組合膳食纖維，可以明顯提高AMPKα蛋白磷酸化水平和IRS-1蛋白水平，而對AKT蛋白磷酸

9、化水平未見明顯影響，且谷豆組合作用優(yōu)于小麥。
　　結(jié)論:
　　(1)谷豆組合與小麥均富含膳食纖維，谷豆組合類黃酮的含量明顯高于小麥，且其膨脹力、持水力，葡萄糖透析延遲能力，體外抗氧化能力均優(yōu)于小麥;
　　(2)谷豆組合與小麥中膳食纖維和類黃酮均能抑制葡萄糖的生成、延緩葡萄糖的轉(zhuǎn)運，但是谷豆組合膳食纖維比小麥膳食纖維、谷豆組合類黃酮和小麥類黃酮的抑制作用更加顯著，可能通過抑制S-I、SGLT1、GLUT2基因、蛋白表達(dá)水