泛素連接酶RNF2-BMI1對食管癌細(xì)胞凋亡遷移能力和細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的:
　　觀察食管癌細(xì)胞接受電離輻射后，BMI1和RNF2蛋白表達(dá)的時間劑量效應(yīng)關(guān)系，利用RNA干擾技術(shù)抑制ECA109食管癌細(xì)胞中BMI1和RNF2的基因表達(dá)，觀察其對細(xì)胞增殖活性、遷移能力、凋亡和細(xì)胞周期的影響，為提高食管癌細(xì)胞放射敏感性奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)ECA109食管癌細(xì)胞株，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測BMI1和RNF2 mRNA水平表達(dá)，流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測BMI1和R

2、NF2蛋白水平表達(dá)，MTT法檢測ECA109食管癌細(xì)胞的增殖狀況。
　　2、將BMI1和RNF2 siRNA轉(zhuǎn)染ECA109食管癌細(xì)胞，western blotting檢測ECA109-B組和ECA109-R組細(xì)胞中BMI1和RNF2的蛋白表達(dá)，F(xiàn)CM檢測6Gy照射后1h、2h、4h、8h、12h、24h，ECA109組、ECA109-N組、ECA109-B組、ECA109-R組細(xì)胞周期分布的變化和凋亡比例，Transwell侵襲

3、小室模型檢測轉(zhuǎn)染ECA109-B組、ECA109-R組細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1、ECA109食管癌細(xì)胞增殖活性和遷移能力
　　1.1 ECA109食管癌細(xì)胞中BMI1和RNF2在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平上均有表達(dá)。與對照組相比，不同劑量照射組食管癌細(xì)胞中，BMI1和RNF2在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P＜0.01)，且隨著照射劑量的增加，BMI1和RNF2表達(dá)水平逐漸增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在1

4、、2、4Gy照射后2h BMI1和RNF2 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均達(dá)到峰值，6Gy、8Gy照射后1h達(dá)到峰值，隨著照射后時間的延長，BMI1和RNF2的表達(dá)量逐漸降低。
　　1.2 MTT檢測結(jié)果顯示，與未照射組相比，各劑量組ECA109食管癌細(xì)胞的增殖水平在照射后不同時間點(diǎn)均明顯降低(P＜0.01)，隨著照射后時間的延長，ECA109組和ECA109-N組細(xì)胞增殖活性逐漸增加，但ECA109-B組和ECA109-R組細(xì)胞在

5、4h、8h、12h及24h的增殖活性均明顯低于ECA109組和ECA109-N組(P＜0.01)。
　　1.3 Western blotting檢測結(jié)果顯示，ECA109-B組、ECA109-R組細(xì)胞中BMI1、RNF2蛋白表達(dá)水平均明顯低于ECA109組和ECA109-N組(P＜0.01)，而ECA109組與ECA109-N組細(xì)胞相比，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　1.4 Transwell侵襲小室模型檢測結(jié)果

6、顯示，照射后3.5h ECA109-B組和ECA109-R組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于ECA109組和ECA109-N組，具有顯著性差異(P＜0.01)，而ECA109組和ECA109-N組穿膜細(xì)胞數(shù)未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。此外，ECA109-B組和ECA109-R組穿膜細(xì)胞數(shù)均低于相應(yīng)未照射組，但差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、ECA109食管癌細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的情況
　　2.1 FCM檢測結(jié)果顯示:未

7、照射組的ECA109、ECA109-N、ECA109-B和ECA109-R細(xì)胞中處于G0/G1期、G2/M期和S期的比例均未見明顯變化(P＞0.05)，6Gy放射線照射后處于G0/G1期細(xì)胞的比例均明顯低于相應(yīng)未照射組(P＜0.01)，且照射后ECA109-B組和ECA109-R組處于G0/G1期的比例均明顯高于照射后的ECA109組和ECA109-N組(P＜0.05)，6Gy放射線照射后各實(shí)驗(yàn)組處于G2/M期的比例明顯高于相應(yīng)未照射組

8、(P＜0.01)，且ECA109-B組和ECA109-R組處于G2/M期的比例均明顯低于照射后的ECA109組和ECA109-N組(P＜0.05)。照射前、后各組處于S期的比例均未見顯著性差異（P＞0.05）。
　　2.26Gy放射線照射后各組ECA109細(xì)胞凋亡率均明顯高于相應(yīng)未照射組(P＜0.05)，照射前，ECA109-B組和ECA109-R細(xì)胞凋亡率較ECA109組和ECA109-N組高，但差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05