AGR2表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞增殖、周期和侵襲能力的影響.pdf

1、食管癌（esophageal cancer，EC）是世界范圍第八大最為常見的惡性腫瘤，每年估計(jì)有450,000新發(fā)生的病例和400,000死亡的病例。EC具有兩種主要的組織學(xué)類型，即鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和腺癌（adenocarcinoma，AC），其主要的差別在于發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、腫瘤生物學(xué)、預(yù)后及治療手段的不同。目前，針對食管癌病人常常采用多種不同模式的治療手段，即食管切除術(shù)聯(lián)合手術(shù)期

2、間的化療或輔助的放化療已經(jīng)證實(shí)能改善病人的預(yù)后，因而成為EC病人標(biāo)準(zhǔn)的治療手段。然而，由于腫瘤侵襲的特性及缺乏有效的個(gè)體治療方法， EC病人的預(yù)后仍然很差，其5年生存率僅保持在36％-47%。因此發(fā)展EC新的治療手段和尋找新的分子靶點(diǎn)對于改善EC病人的預(yù)后具有十分重要的價(jià)值。
　　人前梯度基因2（Anterior gradient2，AGR2）是爪蟾粘腺蛋白XAG-2的一種同源類似物。AGR2基因主要定位于人染色體7p21.3區(qū)域

3、，由8個(gè)外顯子和9個(gè)轉(zhuǎn)錄本構(gòu)成，屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族成員之一，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）中。目前，AGR2的過表達(dá)已經(jīng)在多種不同的腫瘤中被報(bào)道，它能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和惡性轉(zhuǎn)化。最為重要的是，AGR2作為潛在的有希望的診斷標(biāo)志也已經(jīng)被證實(shí)，并可能成為腫瘤新的預(yù)后因子。這些研究充分表明，AGR2可能在多種不同的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)展和

4、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，因而可能成為許多腫瘤潛在的分子治療靶點(diǎn)和預(yù)后因子。
　　然而，AGR2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，為了進(jìn)一步探討AGR2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分析食管鱗癌組織和細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與食管鱗癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系。進(jìn)一步將AGR2 siRNA和siRNA對照轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC1細(xì)胞，研究

5、其表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和侵襲的影響，該研究旨在為以 AGR2為靶點(diǎn)的食管鱗癌的基因治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測97例食管鱗癌組織和對應(yīng)的正常食管上皮組織中AGR2蛋白的表達(dá)。
　?。?）利用SPSS17.0軟件分析 AGR2蛋白的表達(dá)與食管鱗癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。
　?。?）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測隨機(jī)選擇的8例食管鱗癌組織和對應(yīng)的正常食

6、管上皮組織中AGR2 mRNA的表達(dá)。
　　（4）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測不同食管鱗癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　?。?）利用脂質(zhì)體2000，將AGR2 siRNA和siRNA對照分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC1細(xì)胞，并將細(xì)胞分為三組：未處理組、siRNA對照組和AGR2 siRNA組。
　?。?）利用CCK-8試劑檢測不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞增殖能力的變化。<

7、br>　　（7）利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞周期分布的變化。
　?。?）利用Transwell小室檢測不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞侵襲能力的變化。
　?。?）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：上述所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組織化學(xué)的結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)，AGR2蛋白表達(dá)與食管鱗癌病人預(yù)后之間的關(guān)系采用Log-rank（Mantel-Cox）檢驗(yàn)進(jìn)行分析。對于兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，對于3組及以

8、上的比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　（1）AGR2在食管鱗癌組織中的表達(dá)陽性率（82/97，84.5%）顯著高于對應(yīng)的正常食管上皮組織（11/97，11.3%），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?2=104.115， P<0.05）。
　?。?）隨機(jī)選擇的8例食管鱗癌組織中AGR2 mRNA的相對表達(dá)水平均顯著高于其對應(yīng)的8例正常食管上皮組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

9、<0.05）。
　　（3）AGR2蛋白表達(dá)與食管鱗癌病人的性別和年齡均無關(guān)（均P>0.05），但與組織學(xué)分化、臨床分期以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)（所有P<0.05）。
　?。?）Log-rank（Mantel-Cox）檢驗(yàn)的結(jié)果表明，AGR2的表達(dá)與食管鱗癌病人的預(yù)后之間存在明顯的相關(guān)性，AGR2高表達(dá)的食管鱗癌病人的存活時(shí)間顯著低于AGR2低表達(dá)的食管鱗癌病人，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）3株食

10、管鱗癌細(xì)胞株（EC1、Eca109和EC9706）中AGR2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均顯著高于正常食管上皮細(xì)胞Het-1A，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。最為重要的是，食管鱗癌EC1細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均顯著高于其它所研究的細(xì)胞，且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）與未處理組和siRNA對照組相比，AGR2 siRNA組中AGR2蛋白的相對表達(dá)水平顯著下調(diào)，且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義（P<0.05）。
　?。?）與未處理組和siRNA對照組相比，AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞的增殖能力顯著被抑制，且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)的比率為64.77±1.12%，顯著高于未處理的EC1細(xì)胞（52.48±1.26%）和siRNA對照轉(zhuǎn)染的EC1細(xì)胞（52.29±1.24%），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=105.8

12、50，P<0.05）。進(jìn)一步分析表明，AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞在S期的細(xì)胞數(shù)的比率為21.71±0.87%，顯著低于未處理的EC1細(xì)胞（29.09±0.71%）和siRNA對照轉(zhuǎn)染的EC1細(xì)胞（29.40±1.91%），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.859，P<0.05）。此外，AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞在G2/M期的細(xì)胞數(shù)的比率為13.52±1.89%，顯著低于未處理的EC1細(xì)胞（18.43±1.6

13、3%）和siRNA對照轉(zhuǎn)染的EC1細(xì)胞（18.31±1.11%），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.437，P<0.05）。
　?。?）AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞的穿膜數(shù)為52.67±15.01，顯著低于未處理的食管鱗癌 EC1細(xì)胞（132.67±16.50）和 siRNA對照轉(zhuǎn)染的食管鱗癌EC1細(xì)胞（125.33±14.57），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.791，P<0.05）。
　　結(jié)論：
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