枸杞多糖對己烯雌酚致倉鼠及雄性后代生精細胞凋亡的緩解作用.pdf

1、本試驗主要研究己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)染毒雄性成年倉鼠對其睪丸和附睪生精細胞凋亡及其后代生精細胞凋亡的影響及枸杞多糖(Lycium barbarumpolysaccharide，LBP)的緩解作用。將90只成年雄性倉鼠正常飼養(yǎng)7d后，隨機分為6組(n=15)。于末次給藥24 h后，每組均隨機選取5只倉鼠，乙醚麻醉致死，取出睪丸快速分離睪丸周圍的脂肪，放入波恩氏液中固定，制作石蠟切片，應用免疫組化方法測定C

2、aspase-8、Caspase-9、P53、ER及AR的表達與定位;另外摘取兩側(cè)附睪，左側(cè)附睪尾放于波恩氏液中固定，制做石蠟切片，HE染色觀察其組織學變化，免疫組織化學法檢測凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、P53的表達與定位;右側(cè)附睪尾于37℃生理鹽水中剪碎，取精子懸液觀察精子形態(tài)，計算精子密度和畸形率。末次給藥24 h后，各試驗組均隨機選取5只雄性倉鼠，與發(fā)情母鼠按1∶2比例合籠，連續(xù)2個發(fā)情周期(9 d)，每天早晨

3、，對雌鼠進行陰道涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者視為合籠成功，記為孕1d。將懷孕母鼠單獨飼養(yǎng)，期間喂給正常的飼料和水，待其分娩。分別記錄每只母鼠妊娠率、妊娠日期、產(chǎn)仔數(shù)、雌雄比例、仔鼠PND0 d、7d、14d、21d、28 d和56 d體重。飼養(yǎng)雄性仔鼠至性成熟，乙醚麻醉致死倉鼠，取睪丸組織，稱量并計算器官指數(shù)，將睪丸固定在波恩氏液中，制作石蠟切片，觀察組織學變化，并檢測睪丸中Fas、FasL及Caspase-3的表達與定位;分別摘取兩側(cè)附睪，稱

4、重并計算器官指數(shù)，左側(cè)附睪尾放于波恩氏液中固定，制做石蠟切片，HE染色觀察其組織學變化;右側(cè)附睪尾于37℃生理鹽水中剪碎，取精子懸液觀察精子形態(tài)，計算精子密度和畸形率。6個試驗組中剩余的30只雄性倉鼠，繼續(xù)飼喂3個月，觀察3個月后倉鼠睪丸的組織學變化;取附睪，計算精子密度和畸形率。
　　結(jié)果顯示:(1)F0代成年雄性倉鼠用DES處理后，附睪組織形態(tài)發(fā)生明顯變化;補充LBP后，附睪管上皮細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，損傷明顯減少，尤其是在

5、LBP高劑量組（50 mg/kg）是最明顯的，維生素組附睪組織形態(tài)也得到很好的恢復，且LBP高劑量組與維生素組無顯著差異。DES顯著降低F0代倉鼠精子數(shù)量，提高精子畸形率(P＜0.01)，而LBP可以提高F0代雄鼠精子數(shù)量，降低畸形率，維生素對精子數(shù)量和畸形率也有顯著作用。通過免疫組化法檢測證實，DES引起F0代成年倉鼠睪丸內(nèi)生精細胞大量凋亡，顯著提高Caspase-9的表達(P＜0.01);給予不同劑量的LBP后，Caspase-9及

6、P53的達呈劑量依賴性降低，以LBP高劑量組表達最低(P＜0.01)，同時LBP高劑量組的Caspase-8陽性表達與對照組相比差異不顯著。DES顯著降低AR基因的表達(P＜0.01)，添加LBP后，各治療組AR的表達量隨LBP劑量升高而增加。DES能夠使ER基因表達顯著升高，LBP應用后ER表達量均減少。DES可顯著增加F0代倉鼠附睪組織中Caspase-8、Caspase-9及P53的表達(P＜0.01)，添加LBP后，1/10/5

7、0 mg/kg LBP組凋亡蛋白Caspase-8的表達較DES降低(P＜0.01)，10/50 mg/kg LBP組Caspase-9的陽性表達較DES降低(P＜0.01)，50 mg/kg LBP組凋亡蛋白P53的表達較DES降低(P＜0.01)。(2)與DES組雄鼠交配的10只雌鼠中，僅有4只懷孕，1 mg/kg LBP組和10 mg/kgLBP組雌鼠的妊娠率分別為60％和70％，對照組、50 mg/kg LBP組和維生素組雄性倉

8、鼠與發(fā)情雌鼠合籠，3個組中雌鼠全部懷孕。各組間雌鼠妊娠日齡、產(chǎn)仔數(shù)、出生重及仔鼠雌雄比例比較，均差異不顯著。F1代仔鼠PND7 d體重，各組間比較均沒有顯著差異。DES組和維生素組仔鼠PND14 d和PND21 d體重顯著低于對照組和LBP各劑量組(P＜0.05)，LBP各劑量組仔鼠PND14 d和PND21 d體重與對照組沒有顯著差異。DES組仔鼠PND28 d體重與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，LBP各劑量組仔鼠PND28 d

9、體重與對照組相比沒有顯著差異，與對照組相比，維生素組仔鼠PND28 d體重差異明顯(P＜0.05)。仔鼠成年后(PND56d)體重各組之間比較，維生素組為110.77 g，顯著低于對照組的135.80 g(P＜0.05)，DES組和LBP各劑量組與對照組相比沒有明顯差異。F1代倉鼠睪丸重量及其器官指數(shù)各組之間比較，沒有差異。DES組、1/10 mg/kg LBP組和VC+VE組F1代附睪重量及附睪器官指數(shù)和精子數(shù)量低于對照組，而50 m

10、g/kg LBP組與對照組相比差異不顯著。DES組、1 mg/kg LBP組F1代倉鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)有輕微損傷，10/50 mg/kgLBP組睪丸組織接近正常;各組間F1代附睪組織形態(tài)正常。各組間F1代倉鼠精子畸形率比較無顯著性差異。DES組、1 mg/kg LBP組F1代睪丸中Fas的表達較對照組顯著增高(P＜0.01)，10/50 mg/kg LBP組和維生素組無顯著變化。DES組、1/10mg/kg LBP組F1代睪丸中FasL的陽

11、性表達較對照組顯著增高(P＜0.01)，50 mg/kgLBP組和VC+VE組相比差異不顯著。F1代睪丸組織中Caspase-3的陽性表達，除DES組顯著高于對照組外其他各組與對照組相比沒有差異。(3)經(jīng)過3個月的恢復后，各組的睪丸和附睪重量及睪丸組織形態(tài)皆恢復到正常水平，精子畸形率也降低到正常水平，DES組、1/10 mg/kg LBP組和VC+VE組精子數(shù)量顯著低于對照組，50 mg/kg LBP組恢復到對照組水平。各組倉鼠恢復3個

12、月后，其體重均較用藥結(jié)束時有顯著增加(P＜0.01);睪丸重量較用藥結(jié)束時均有增加，但沒有顯著差異;1 mg/kgDES組和維生素組附睪重量分別增加81.25％和55.81％，但差異不顯著;1 mg/kgLBP組和10 mg/kg LBP組附睪重量恢復前后比較，差異顯著(P＜0.05);而50 mg/kgLBP組附睪重量由0.46 g增加到0.73 g，差異極顯著(P＜0.01)。經(jīng)過3個月恢復后，DES組、1/10 mg/kg LBP

13、組和維生素組精子數(shù)量與結(jié)束用藥時相比，精子數(shù)量均顯著增加(P＜0.01);50 mg/kg LBP組精子數(shù)量恢復前后變化不明顯。精子畸形率恢復前后的比較結(jié)果顯示，各組倉鼠恢復3個月后，精子畸形率均較結(jié)束用藥時顯著降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1) DES造成睪丸生精細胞大量凋亡，改變附睪結(jié)構(gòu)，增加附睪凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9和P53表達，擾亂AR和ER正常功能，降低精子數(shù)量，增加精子畸形率，導致成年雄性

14、倉鼠生殖損傷，生育能力降低。補充不同劑量的LBP后，LBP減少睪丸生精細胞和附睪上皮細胞凋亡，使附睪損傷程度減輕，糾正AR和ER功能，增加精子數(shù)量，減少精子畸形率，緩解DES對F0代雄性倉鼠造成的生殖損傷。(2) DES對F1代倉鼠生殖能力造成不良影響，包括降低仔鼠PND14d、21d、28d和56d體重，降低F1代附睪重量及其器官指數(shù)，減少精子數(shù)量，增加睪丸生精細胞Fas/FasL及Caspase-3蛋白的凋亡。應用LBP后，可以緩解