相對(duì)低劑量己烯雌酚對(duì)小鼠睪丸引帶細(xì)胞PKC-PKA通路的影響.pdf

1、目的：
　　目前大量研究資料證實(shí)外源性雌激素（EEs）與雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常（畸形）密切相關(guān)，其具體影響及作用機(jī)理尚不明確。既往大多研究集中在對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的核心器官睪丸的研究上，對(duì)與睪丸發(fā)育及下降密切相關(guān)的睪丸引帶（gubernaculum testis）的研究甚少。睪丸引帶對(duì)睪丸的下降發(fā)育過(guò)程起著引導(dǎo)、牽引，以及固定等作用。既往研究發(fā)現(xiàn)己烯雌酚（DES），一種經(jīng)典的EEs導(dǎo)致小鼠睪丸引帶組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞的增殖和收縮功能異常

2、，并發(fā)現(xiàn)DES作用于睪丸引帶細(xì)胞引起[Ca2+]i瞬時(shí)變化，提示可能與細(xì)胞鈣通道信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)PLC酶抑制劑U-73122預(yù)作用下，相對(duì)低劑量DES對(duì)小鼠睪丸引帶細(xì)胞[Ca2+]i和CREB蛋白磷酸化水平的影響，探討PKC/PKA信號(hào)通路在相對(duì)低劑量DES影響小鼠睪丸引帶細(xì)胞中的作用，以進(jìn)一步了解DES影響睪丸引帶細(xì)胞增殖性和收縮功能的作用機(jī)理，或有助于揭示EEs影響睪丸下降發(fā)育，甚至影響泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育的可能機(jī)理。
　

3、　方法：
　　將培養(yǎng)的傳代小鼠睪丸引帶細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.01％PBS，v/v）、溶劑對(duì)照組（0.01%DMSO組，v/v）、U-73122實(shí)驗(yàn)組1-6（U-73122終濃度分別為0.1、0.25、0.5、1、5和10μmol/L）、DES組（1.5×10-8 mol/L DES）和U-73122+DES組（1μmol/L U-73122預(yù)先作用細(xì)胞10 min后再加入1.5×10-8 mol/L DES）共10組。分別采

4、用共聚焦顯微鏡[Ca2+]i測(cè)定法、CCK-8分析法及Western Blot方法檢測(cè)PLC酶抑制劑U-73122對(duì)小鼠睪丸引帶細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞[Ca2+]i的影響以及PLC酶抑制劑U-73122干預(yù)后相對(duì)低劑量DES對(duì)小鼠睪丸引帶細(xì)胞增殖性、[Ca2+]i和CREB磷酸化蛋白（P-CREB）表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.1μmol/L及低于此濃度的U-73122作用于睪丸引帶細(xì)胞，小鼠睪丸引帶細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)正常。

5、U-73122濃度≥5μmol/L時(shí)引帶細(xì)胞出現(xiàn)大部分死亡。U-73122各組加藥瞬間小鼠睪丸引帶細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的熒光強(qiáng)度變化率[(F0-Fmin)/F0]為12.58%、18.72%、38.96%、55.81%、63.59%、95.17%，與溶劑對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.DES可影響睪丸引帶細(xì)胞的增殖性，并存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系（r=0.9193）。與同時(shí)間段DES組相比較，U-73122+DES組O

6、D值明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.DES組加藥瞬間細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的熒光強(qiáng)度變化率[(Fmax-F0)/F0]為143.32%，與溶劑對(duì)照組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。U-73122+DES組的熒光強(qiáng)度變化率為15.57%，與DES組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.DES組能在3 h內(nèi)不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞p-CREB表達(dá)增加，與溶劑對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0

7、.05）。與同時(shí)間段DES組相比較，U-73122+DES組（除30min外）p-CREB的表達(dá)均明顯降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.PLC酶抑制劑U-73122影響小鼠睪丸引帶細(xì)胞[Ca2+]i水平，且存在劑量--效應(yīng)關(guān)系。1μmol/L U-73122對(duì)睪丸引帶細(xì)胞正常生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。采用1μmol/L U-73122探討DES對(duì)睪丸引帶細(xì)胞中PKC/PKA通路的影響。
　　2.PL