靶向TGF-βⅡ型受體的適配子殼聚糖緩釋凝膠對大鼠濾過術(shù)后結(jié)膜瘢痕的作用研究.pdf

1、背景:
　　目前抗青光眼手術(shù)是青光眼降眼壓治療的主要治療方式，而濾過通道結(jié)膜瘢痕是手術(shù)失敗的主要原因，因此通過抑制結(jié)膜瘢痕化以提高抗青光眼手術(shù)的成功率仍是眼科研究的重要方向之一。目前臨床上廣泛應(yīng)用絲裂霉素C(MMC)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)降低青光眼術(shù)后瘢痕化，提高濾過術(shù)成功率，但仍然存在某些并發(fā)癥，包括愈合延遲、術(shù)后淺前房、濾過泡滲漏及角膜毒性等，嚴(yán)重影響手術(shù)效果1,2。臨床上尚缺乏有效的、毒副作

2、用小的藥物以減少瘢痕形成，延長濾過泡生存時間。
　　研究報道轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在結(jié)膜瘢痕形成過程中起重要作用，并且在青光眼房水中發(fā)現(xiàn)其含量增加3-5?？估w維化治療的一個重要方向就是靶向配體或者受體作用，特異性阻斷TGF-β作用，可減弱結(jié)膜組織的纖維化4,6,7。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過與細(xì)胞膜上的受體(transforming growth factor-

3、β receptor,TβR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，TGF-β首先與TβRⅡ結(jié)合再與TβRⅠ形成TGF-β-TβRⅡ-TβRⅠ復(fù)合體，TβRⅡ磷酸化TβRⅠ的GS區(qū)，啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)8-11。TGF-β與TβRⅡ的結(jié)合是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開始的始動因素，通過靶向TβRⅡ以抑制配體與受體相結(jié)合達(dá)到減弱其生物學(xué)效應(yīng)的作用。本課題組前期應(yīng)用SELEX(systematic evolution of ligands byexponential enric

4、hment)篩選得到靶向TβRⅡ胞外段的特異核酸適配子，是一類功能與抗體類似的新型分子，具有親和力高、組織穿透能力強(qiáng)等特點(diǎn)12。在人Tenon囊成纖維細(xì)胞(HTFs)上進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證了適配子S58可通過靶向結(jié)合TβRⅡ從而抑制TGF-β的作用，結(jié)果顯示適配子S58可抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HTFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化13。為了延長核酸適配子的作用時間，更好地應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們使用殼聚糖(chitosan，CS)納米微粒包裹適配子S58

5、(CS/S58)，延長其作用時間14。
　　殼聚糖溫敏型水凝膠作為一種新型的可用于可注射、非靜脈的給藥方式，具有優(yōu)異的控釋、緩釋、靶向性，可將藥物直接送達(dá)病原部位，選擇性地釋放藥物，既可以保護(hù)藥物不被酶解，又使藥物在靶區(qū)達(dá)到所需的藥物濃度，提高療效減少藥物的毒副作用;此外，殼聚糖無毒，且有良好的生物相容性和降解性15-19。研究表明殼聚糖可抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖20，21，因此本研究制備了殼聚糖溫敏型水凝膠包被適配子S58，觀察

6、其對結(jié)膜瘢痕化過程的作用。
　　目的:
　　本研究擬在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選具有阻抑作用的適配子，并將篩選的適配子S58應(yīng)用殼聚糖凝膠包被，以增加適配子作用時間，減少酶類的降解，進(jìn)一步探討殼聚糖/適配子S58溫敏緩釋凝膠(CS/S58)在大鼠濾過術(shù)模型中的抗瘢痕形成的作用。
　　方法:
　　1.通過原代培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞（human Tenon fibroblast，HTF），觀察TGF-β2誘導(dǎo)HTF轉(zhuǎn)分

7、化的作用，檢測核酸適配子對TGF-β2作用的干擾效應(yīng)，Westernblot及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測α-SMA、pSmad2的表達(dá)情況，進(jìn)一步篩選具有阻抑作用的核酸適配了;
　　2.制備殼聚糖溫敏型凝膠，應(yīng)用該凝膠包被核酸適配子，在體外檢測凝膠的包被率及適配子的緩釋效應(yīng);
　　3.構(gòu)建大鼠青光眼濾過術(shù)(glaucoma filtration surgery，GFS)模型，分別用TGF-β2、MMC、殼聚糖凝膠(CS)和CS/S

8、58凝膠處理球結(jié)膜瓣，應(yīng)用裂隙燈及AS-OCT觀察濾過泡的形態(tài)及存活時間，監(jiān)測眼壓變化，狼紅染色觀察于術(shù)區(qū)膠原纖維的沉積;Western blot及組織免疫化學(xué)染色檢測手術(shù)區(qū)結(jié)膜組織表達(dá)CollagenⅠ、αt-SMA情況，檢測組織的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖與凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β2誘導(dǎo)HTF表達(dá)α-SMA，并且2 ng/ml、5 ng/ml濃度組作用達(dá)高峰，2ng/ml與5 ng/ml TGF-β2組α-SM

9、A表達(dá)差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);TGF-β2可促進(jìn)HTF骨架蛋白F-actin及pSmad2的表達(dá)，并顯著增強(qiáng)HTF的收縮力。
　　2.適配子S58(20 nM)可阻抑TGF-β2(2 ng/ml)誘導(dǎo)HTF表達(dá)α-SMA、F-actin的作用，減弱Smad2磷酸化水平以及pSmad2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位;并抑制TGF-β2介導(dǎo)HTF細(xì)胞收縮;適配子S68對TGF-β2誘導(dǎo)HTF的作用無明顯影響。
　　3.建立殼聚糖/

10、β-甘油磷酸鈉(CS/β-GP)溫敏型凝膠系統(tǒng)，CS/β-Gp溶液于37℃水浴2～3 min可由液體轉(zhuǎn)變?yōu)樗z，摩爾比為1∶2.6包被適配子S58，包被率達(dá)到88.4±7.2％，體外可持續(xù)緩釋，1mo的持續(xù)緩釋率為84±6.0％。
　　4.采用微管植入法構(gòu)建大鼠GFS模型，濾過泡生存比率=術(shù)后28 d/術(shù)后3d濾過泡面積×100％，每組至少有8只大鼠，Control組濾過泡生存比率為17±7％，TGF-β組為15±5％，MMC組

11、為30±7％，CS組為28±8％，CS/S58組為36±9％;TGF-β、MMC、CS及CS/S58組與對照組相比的平均眼壓比例分別為95±14％、103±12％、84±21％、78±18％、72±20％。
　　5.GFS術(shù)后1 w TGF-β2(2 ng/ml)組手術(shù)區(qū)球結(jié)膜可見大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞大量增殖，結(jié)膜組織下致密的膠原纖維沉積，ColⅠ、α-SMA表達(dá)明顯增加;MMC(0.4 mg/ml)處理的球結(jié)膜區(qū)細(xì)胞數(shù)量稀少，

12、組織疏松，細(xì)胞凋亡較多，結(jié)膜上皮下仍可見較多膠原纖維沉積。
　　6.CS凝膠組GFS術(shù)后1w結(jié)膜下仍可見未吸收的殼聚糖，殼聚糖周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，以及部分凋亡的細(xì)胞，與對照組相比較，CS凝膠未加重結(jié)膜組織的膠原沉積，ColⅠ表達(dá)反而降低;與CS組比較，CS/S58凝膠組炎性細(xì)胞浸潤較少，膠原纖維沉積減少，ColⅠ、α-SMA表達(dá)均明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，靶向TβRⅡ的核酸適配子S58可阻抑

13、TGF-β2誘導(dǎo)HTF向MF轉(zhuǎn)分化，并阻抑pSmad2的表達(dá)以及其胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，提示適配子S58可干擾TGF-β與其受體相結(jié)合，減弱TGF-β的生物學(xué)作用;
　　2.TGF-β2可加重濾過泡的炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致手術(shù)區(qū)結(jié)膜組織下致密膠原纖維沉積，濾過泡生存時間明顯縮短，進(jìn)一步明確TGF-β2促進(jìn)結(jié)膜瘢痕形成的機(jī)制;MMC可能通過抑制組織細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡而延長濾過泡的生存時間;
　　3.殼聚糖溫敏凝膠可有效的包被適