靶向TGF-βⅡ型受體的核酸適配子-殼聚糖納米微粒的制備及干擾TGF-β2介導(dǎo)人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用的研究.pdf

1、背景:
　　青光眼濾過手術(shù)是當(dāng)前治療青光眼的重要手術(shù)方法,但是手術(shù)后濾過泡的瘢痕化是影響手術(shù)成功率的主要因素。濾過泡的瘢痕化與多種致纖維化因子的活性密切相關(guān),其中轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的作用至關(guān)重要,其亞型TGF-β2在眼部瘢痕疾病的發(fā)生中又起主要作用。TGF-β與其Ⅱ型受體(TGF-βreceptor Ⅱ,TβRⅡ)結(jié)合作為致組織纖維化的始動環(huán)節(jié),促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、分化為具有收縮功能的肌成纖維細(xì)胞,在瘢痕化的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。因此,通過拮抗或者阻抑TGF-β與TβRⅡ的結(jié)合,可為青光眼術(shù)后抗瘢痕治療提供新的方法。目前利用具有靶向性的適配子及抗體可實現(xiàn)對上述過程的干預(yù)。本課題組在前期的研究中使用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)篩選得到了靶向TβRⅡ的核酸適配子S58,并證明了適

3、配子S58可抑制TGF-β介導(dǎo)的人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)的轉(zhuǎn)分化作用,但是核酸適配子存在易被核酸酶降解、作用時效短等缺點。而瘢痕修復(fù)大約從術(shù)后第三天開始,直至術(shù)后一個月左右瘢痕完全形成。因此保持適配子的生物活性,延長其作用時間很重要?；瘜W(xué)性修飾,如硫修飾能夠增強(qiáng)核酸的穩(wěn)定性,但同時增強(qiáng)了其細(xì)胞毒性及非特異效應(yīng)。因此,選擇一種有效且安全的方法來保持核酸適配

4、子的生物活性,顯得很有必要。殼聚糖(chitosan)是一種天然的陽離子聚合物,因為其良好的生物降解性、生物相容性、較低的免疫原性,以及突出的大分子粘附能力,近年被廣泛應(yīng)用于大分子、核酸、蛋白質(zhì)的載體研究中。已有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米化后作為寡核苷酸的載體,可有效保護(hù)寡核苷酸免于被核酸酶所降解。因此,將殼聚糖納米微粒作為核酸適配子S58的載體,有望成為保持并延長S58生物活性的一種理想手段。
　　目的:
　　本研究擬在合成一種靶

5、向TGF-βⅡ型受體的新型核酸適配子-殼聚糖納米微粒復(fù)合物CS(S58)-NP,并對其特性及抑制TGF-β介導(dǎo)的人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)行研究。
　　方法:
　　首先使用離子交聯(lián)法制備出不同殼聚糖納米微粒(chitosan-nanoparticles,CS-NP)與適配子S58摩爾比的CS(S58)-NP;然后應(yīng)用動態(tài)光散射法檢測CS(S58)-NP的粒徑及其Zeta電位;用掃描電子顯微鏡觀察粒徑的大小、形態(tài)及分

6、布情況;采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測CS-NP與S58的結(jié)合情況,并評估CS(S58)-NP對血清的抵抗能力;體外緩釋實驗檢測CS(S58)-NP緩釋S58的情況;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的CS(S58)-NP與HTFs的結(jié)合情況;利用乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測CS(S58)-NP對HTFs的細(xì)胞毒性;最后使用westernblot法檢測平滑肌肌動蛋白

7、(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.CS(S58)-NP的粒徑分布于137.2~274.6nm之間,并且隨著CS-NP與S58摩爾比的增大而減小,Zeta電位分布于+4.54~+27.7mV之間,并且隨著CS-NP與S58摩爾比的增大而增大;掃描電子顯微鏡下可觀察到CS(S58)-NP為球形微粒,分布均勻,粒徑大部分在300nm以內(nèi);CS(S58)-NP的包封率最高達(dá)到

8、了91.7±7.4％;CS-NP/S58摩爾比為20和30的CS(S58)-NP,CS-NP與S58結(jié)合較為完全;CS-NP/S58摩爾比為20和30的CS(S58)-NP抗血清酶解能力超過48小時,緩釋S58達(dá)到96小時。
　　2.激光共聚焦顯微鏡下能夠觀察到FITC標(biāo)記的CS(S58)-NP與HTFs結(jié)合;當(dāng)CS(S58)-NP使用濃度為25nM時,LDH相對釋放率為6%左右,使用濃度增至100nM時,LDH相對釋放率為20%

9、左右,CS(S58)-NP在有效作用濃度下表現(xiàn)出良好的生物相容性。
　　3.TGF-β介導(dǎo)的α-SMA表達(dá)受到CS(S58)-NP的明顯抑制,且成濃度依賴性,使用濃度為100nM時可抑制α-SMA表達(dá)達(dá)60%左右;在血清存在的情況下,S58在6小時內(nèi)具有明顯抑制α-SMA表達(dá)的作用,CS(S58)-NP在12到48小時時間段表現(xiàn)出明顯的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　CS(S58)-NP具有明顯的適配子保護(hù)能力、穩(wěn)定的緩釋