靶向TGF-βⅡ型受體胞外段核酸適配子S58結構優(yōu)化篩選及結合位點預測研究.pdf

1、研究背景:
　　青光眼濾過手術是目前治療青光眼最重要的方法,但是手術失敗的主要原因是手術后濾過泡的瘢痕纖維化。臨床上往往術中使用5-氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)等抗代謝藥物來抑制術后濾過泡的疤痕形成,以提高手術成功率,但仍然有諸如濾過泡滲漏、低眼壓、眼內(nèi)炎、角膜損傷等并發(fā)癥的發(fā)生。因此,尋求一種更為安全、有效、毒性小的藥物作用于抗青光眼術后抑制瘢痕形成是目前的研究熱點。濾過泡的瘢痕化與多種致纖維化因子的活性密切相關,其

2、中轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的作用至關重要,其亞型TGF-β2在眼部瘢痕疾病的發(fā)生中起主要作用。TGF-β與其Ⅱ型受體(TGF-β receptorⅡ,TβRⅡ)結合作為致組織纖維化的啟動環(huán)節(jié)中的關鍵步驟,促使成纖維細胞轉分化為具有收縮功能的肌成纖維細胞,合成大量的細胞外基質,在組織瘢痕化的發(fā)生中起至關重要的作用。因此,通過拮抗或者封阻TGF-β與TβRⅡ的結合,可以作為青光

3、眼術后抗瘢痕治療新的研究途徑。
　　本課題組在前期的研究中使用SELEX技術篩選得到了靶向TβRⅡ胞外段的核酸適配子S58,并在體外實驗中驗證 S58能有效抑制人成纖維細胞α-SMA表達,且能明顯阻抑TGF-β2介導的成纖維細胞轉分化、細胞收縮作用。初步篩選出來的核酸適配子一般作為先導分子,需要進一步進行結構優(yōu)化或者基團修飾,尋找到能發(fā)揮功能的最佳序列。大多數(shù)適配子的兩端序列是固定側翼序列,對其功能影響較微弱,核酸適配子S58是含

4、60個左右堿基的核酸,其合成成本較高,因此本研究將S58進行結構優(yōu)化,分別從兩端逐步剪切縮短序列,去掉冗余的序列,得出新的較短適配子DNA,并在體外分別驗證核酸適配子58及優(yōu)化后ssDNA的結合力情況,從細胞水平驗證其生物學效應,從中篩選出發(fā)揮最佳效果的最短適配子序列,為青光眼術后抗瘢痕治療尋找到新的替代藥物,并為下一步藥效動力學實驗及體內(nèi)實驗提供的理論基礎。
　　適配子能發(fā)揮作用是基于其能識別靶分子上不同的基團,并自身發(fā)生適應性

5、結構改變使其能與靶分子緊密結合形成穩(wěn)定的空間結構,故常常具有與抗體相似甚至更高的親和力、特異性。因此研究適配子的作用機制重點在于研究其空間結構及與靶分子的結合位點。伴隨分子生物學和信息科學飛速的發(fā)展,利用生物信息學方法探索蛋白質與核酸相互作用能提高其有效性,縮短研究工作的時間,達到事半功倍的效果,生物信息學已經(jīng)成為研究生物領域課題的一項指導科學。因此運用生物信息學方法建立篩選出的最佳核酸適配子的三維模型,研究其與受體蛋白的結合位點是尤為

6、必要并且可行的,旨在初步探索最佳核酸適配子發(fā)揮體外生物高效應的作用機理。
　　目的:
　　本研究擬將根據(jù)靶向TβR胞外段核酸適配子S58序列進行剪切縮短,合成新的較短適配子DNA,并在體外進行其結合力、生物學效應的驗證研究,篩選出發(fā)揮最佳生物功能的適配子,為抗青光眼術后抗瘢痕治療提供新的思路。進一步運用生物信息學建立適配子的三維模型,并預測其與受體蛋白的結合位點,對最佳適配子發(fā)揮體外作用的機理進行初步研究。
　　方法:

7、
　　1.激光共聚焦顯微鏡觀察核酸適配子S58與成纖維細胞的結合情況,根據(jù)核酸適配子S58序列從兩端逐步剪切縮短,每次剪切掉5bp,得到7個新的較短適配子ssDNA,運用生物傳感器芯片包被受體蛋白后分別檢測核酸適配子S58及結構優(yōu)化后的ssDNA的親和力大小。流式細胞儀技術檢測熒光標記后的核酸適配子S58及結構優(yōu)化后的ssDNA與HTFs的結合率情況。從而篩選出結合力最強的適配子。
　　2.核酸適配子S58及結構優(yōu)化后的ss

8、DNA與TGF-β一同作用于HTFs24小時后運用蛋白質印跡法檢測細胞的α-SMA的表達量,核酸適配子 S58及結構優(yōu)化后的ssDNA與TGF-β共同作用48h后檢查成纖維細胞凝膠的收縮情況。從而篩選出體外生物學效應最佳的適配子。
　　3.通過核酸適配子序列轉錄為RNA序列,運用軟件建立其RNA的三維模型,再轉換為ssDNA的三維模型,Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫搜索到受體蛋白TβRII胞外段的晶體結構,比對

9、確認最有可能在溶液中與適配子結合的三維晶體結構,然后對DNA分子和蛋白質分子進行半柔性分子對接實驗,統(tǒng)計聚類分析核酸適配子的結合情況,根據(jù)函數(shù)打分及經(jīng)驗選擇出最可靠的核酸適配子與受體胞外段蛋白的復合物模型,運用軟件準確分析其結合位點。
　　結果:
　　1.激光共聚焦顯微鏡下能夠觀察到5’端標記的FITC-S58熒光顯示與HTFs排列形態(tài)一致;在相同濃度下,S58與TβRⅡ的結合反應峰值維持在350arc/s,其次為S583’

10、端剪切5bp結合反應峰值達200arc/s,S583’端剪切10bp結合反應峰值達160arc/s, S583’端剪切15bp僅為130 arc/s,S585’端剪切的結合反應峰值均僅達80~120arc/s。相同濃度為5nmol/L時,FITC-58與HTFs的結合率為72.9％,而5’端剪切的ssDNA S58-1~4的細胞結合率分別為:39.0%、27.6%、23.5%、22.3%,3’端剪切的ssDNA S58-5~7的細胞結合

11、率分別為:41.4%、38.7%、23.9%。
　　2.Western Blot結果顯示所有剪切縮短的ssDNA組中只有TGF-β2+S583’-5bp組較TGF-β2組α-SMA表達有明顯降低(P=0.000),但其降低程度仍比TGF-β2+S58組低,其他組與TGF-β2組比較α-SMA表達均無差異(P>0.05)。細胞收縮實驗中TGF-β2組刺激后HTFs收縮后是原面積的11.6%,TGF-β2+S58組刺激后HTFs收縮后

12、是原面積的63.2%,與 TGF-β2組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),而TGF-β2+S585’-5bp組及TGF-β2+S583’-5bp組刺激后HTFs收縮后是原面積的9.7%、10.4%,與TGF-β2組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　3.TβRII胞外段蛋白由122個氨基酸組成,有10種自然態(tài)結構,并且是以二聚體結構存在,最有可能在溶液中與適配子結合的三維晶體結構是1PLO-3。核酸適配子S58是60個堿基的

13、寡核苷酸,形成三維結構時發(fā)生自身適應性互補形成局部雙螺旋結構,聚類分析找出DNA與受體蛋白的結合面。根據(jù)對接后函數(shù)打分找到最可能的復合物模型,再分析其結合位點分別包括位點I(T4、T5、G6、C7)、位點II(G13、A14、T15、C16、G17、C18)、位點III(T31、G32、T33、C34)及位點IV(G40、A41、T42、T43、T44、G45、G46號)。
　　結論:
　　1.剪切后的ssDNA中S58-5

14、即S583’端剪切5bp與TβRⅡ結合力最強,但仍較S58降低。同樣剪切后的ssDNA與HTFs的結合率也較S58降低。因此,核酸適配子S58的結合力仍是最佳的,5’端及3’端剪切后得到的新ssDNA結合力均較S58均下降,并且剪切堿基越多,結合力越低。
　　2.體外核酸適配子S58能抑制TGF-β2誘導的HTFs轉分化、收縮作用,剪切縮短后的ssDNA中只有S583’端剪切5bp對TGF-β2誘導的HTFs轉分化有一定抑制作用,

15、但作用比S58弱,其他縮短后的ssDNA均無明顯作用,并且剪切堿基越多,作用越弱。因此核酸適配子S58的生物學效應仍是最佳的,5’端及3’端剪切都會影響其生物功能。
　　3.核酸適配子S58與TβRⅡ胞外段的結合位點較緊密。5’端剪切5bp就會剪切掉結合位點I(T4、T5、G6、C7)中的T4,同樣,5’端剪切10bp、15bp、20bp還影響到位點II(G13、A14、T15、C16、G17、C18),因此5’端剪切會顯著影響適