徐淮山羊Sox2、c--Myc和Oct4基因啟動子功能的初步研究.pdf

1、本研究由國家轉(zhuǎn)基因重大專項“優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因肉羊新品種培育“ ( N o ．2 0 1 1 Z X 0 8 0 0 8 —0 0 3 ；N o ．2 0 1 3 Z X 0 8 0 0 8 ．0 0 3 )資助完成T h e P r o j e c tw a s S u p p o S e d b y N a t i o n a lN e w V a r i e t i e so fG e n e t i c a l l y M o d i

2、f i e d O r g a n i s m s c u l t i v a t i o n ( N o ．2 0 11Z X 0 8 0 0 8 —0 0 3 ；N o ．2 0 1 3 Z X 0 8 0 0 8 - 0 0 3 )旦 揚州I 大學(xué)博士學(xué)位論文維細(xì)胞后，均能檢測到綠色熒光，表明S o x 2 基因，c ．M y c 基因和O c t 4 基因的長片段均能肩動E G F P 的表達(dá)，具有啟動子活性。3 ．用包含不同長

3、度的S o x 2 基因啟動子的熒光素酶載體，不同長度c ．M y c 基因啟動子的熒光素酶載體，不同片段大小的O c t 4 基因啟動子的重組載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維( g E F ) 、猴。腎( C O S 7 ) 和小鼠畸胎瘤細(xì)胞( P 1 9 ) ，轉(zhuǎn)染2 4h 后，收集細(xì)胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定其啟動子活性。結(jié)果顯示：不同長度的S o x 2 基因啟動子在以上3 種細(xì)胞中均表現(xiàn)出不同程度的活性。其中片段．1 2 9

4、 8 ～+ 4 9b p 活性最高，片段一1 0 9 ～+ 4 9 b p 活性最低，．2 2 4 ～+ 4 9b p 之間存在著S o x 2 啟動子的基本調(diào)控元件。．4 8 4 ～．1 0 9 b p 、．7 5 5 ～．1 2 4 9b p 區(qū)域存在重要的正調(diào)控元件，．5 3 3 ～．7 5 5b p 、．1 2 4 9 ～．1 7 9 2b p 區(qū)域存在重要的負(fù)調(diào)控元件。不同長度的C —M y c 基因啟動子在以上3 種細(xì)胞中均

5、表現(xiàn)出不同程度的活性。c —M y c 基因啟動子片段．1 3 3 4 ～+ 1 b p 活性最高，片段一1 4 7 ～+ 1 b p 活性最低，．4 0 2 ～+ 1b p 之間存在著c - M y c 啟動子的基本調(diào)控元件。一1 3 4 4 ～．9 7 1b p 、．5 8 7 ～．1 4 7b p 區(qū)域含有關(guān)鍵的正調(diào)控元件，．1 9 7 6 ～一1 3 3 4 b p 、．9 7 1 ～．5 8 7b p 區(qū)域存在重要的負(fù)調(diào)控元件

6、。在以上3 種細(xì)胞中，O c t 4 基因不同大小片段的啟動子都能夠檢測到不同強度的活性。O c t 4 基因啟動子．1 5 1 6 “ - - - + 3 0 b p 片段活性最高，片段．9 6 ～+ 3 0 b p 活性最低。啟動子基本活性區(qū)域為．2 3 8 一+ 3 0 b p ；．1 5 1 6 - - - - 一9 4 6b p ，一6 1 5 ～．9 6b p 區(qū)域存在重要的正調(diào)控元件。而．1 9 3 6 ～．1 5 1 6

7、b p 、一9 4 6 ．6 1 5b p 區(qū)域存在重要的負(fù)調(diào)控元件。4 ．通過T F S E A R C H 預(yù)測，S o x 2 基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游．2 2 4 ．1 0 9 b p 區(qū)域含有N F —Y ，S P l ，E l g l ，A P ．2 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，c ．M y c 基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游．4 0 2 - - 一一1 4 7 b p 區(qū)域包含S P l ，C ／E B P ，A d f - 1 ，N F —k

8、 a p 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，O c t 4 基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游．2 3 8 ～．9 6b p 區(qū)域存在S P l ，S T R E ，M Z F l ，A M L ．1 a 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。對各基因預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行堿基定點突變，對比突變前后啟動子活性的變化。結(jié)果表明：S o x 2 基因一2 2 4 ．1 0 9 b p 區(qū)域的E l f - 1 和A P 一2 是參與調(diào)控其基本轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，c ．M y c

9、 基因．4 0 2 ．1 4 7b p 區(qū)域的S P I 和C ／E B P 是參與調(diào)控其基本轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，O c t 4 基因．2 3 8 ～．9 6b p 區(qū)域的S P l 與M Z F l 是參與調(diào)控其基本轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。5 ．在轉(zhuǎn)染重組熒光素酶載體的基礎(chǔ)上，采用終濃度為1g m o l ／L 、5 p m o l ／L 、1 0g m o l ／L和1 5l a m o l ／L 的甲基化抑制劑5 - A z