白芍總苷對大鼠體內(nèi)細(xì)胞色素P450的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的:白芍總苷(Total glucosides of paeony, TGP)是白芍的有效部位，主要含有芍藥苷（paeoniflorin，Pae）、芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin，Alb)等單萜類成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實TGP具有明顯的保肝作用，能顯著對抗多種因素所致的急慢性肝損傷、肝纖維化等。課題組前期對TGP在正常和病理狀態(tài)下的吸收、分布、排泄進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，并對白芍總苷在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。細(xì)胞色素P450酶是機

2、體內(nèi)最重要的藥物代謝酶，參與藥物及各種內(nèi)源性、外源性化合物在體內(nèi)的代謝過程。因此為了更深入的了解TGP在大鼠體內(nèi)的代謝過程，本實驗進(jìn)一步研究了TGP對細(xì)胞色素P450酶的影響，分別采用Western Blot和RT-PCR兩種方法從蛋白和mRNA兩個層面研究TGP對正常大鼠和CCl4肝損傷大鼠6種細(xì)胞色素P450亞型酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1的影響，以期探討白芍總苷對大鼠細(xì)胞色

3、素P450的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1、白芍總苷對正常大鼠6種CYP450亞型酶的影響
　　1.1實驗動物分組與給藥
　　健康Wistar大鼠25只，♂，體重(180～220)g，隨機分為5組:空白對照組，TGP低、中、高劑量給藥組，陽性給藥組。每組5只，正常對照組給予純化水，TGP低、中、高給藥組灌胃給予TGP0.47 g/kg、1.41g/kg、2.82 g/kg，陽性對照組腹腔注射地塞米松注射液75 m

4、g/kg，連續(xù)14天，末次給藥24 h后斷頭處死各組大鼠，迅速取肝，4℃預(yù)冷生理鹽水中冷卻，吸干水分，稱重，將肝組織剪碎，洗凈血液，分裝于凍存管中，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　1.2蛋白免疫印跡法測定6種CYP450亞型酶蛋白表達(dá)
　　采用差速離心法制備肝微粒體。肝組織按1∶4(g∶mL)加入0.25mol/L蔗糖溶液，勻漿器制備肝勻漿，9000 g離心20 min，取上清液于19000g離心20 min，再次取上清液

5、60000 g離心60 min，下層粉紅色沉淀即為肝微粒體，沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl（含20％甘油，pH=4）混懸均勻，分裝，干冰速凍，-80℃貯存?zhèn)溆茫捎肂ranford方法測定肝微粒體的蛋白濃度。Western Blot法檢測TGP對CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響
　　1.3 RT-PCR法測定6種CYP450亞型酶mRNA表達(dá)
　　

6、應(yīng)用Omiga2.0引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計。采用Trizol法提取肝臟中的RNA。取100 mg肝組織于研缽中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1 mL Trizol室溫下放置5 min，再加入氯仿0.2 mL，劇烈顛倒混勻，室溫放置5 min，4℃，12000 g離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相400μL于另一新1.5 mL EP管中，加等體積異丙醇混勻后-20℃放置30min，然后4℃，12000 g離心10 min，棄上清，加冰預(yù)

7、冷的75％乙醇1mL洗滌RNA，4℃，7500 g離心5 min，棄上清，在超凈臺中自然風(fēng)干RNA沉淀至沉淀呈半透明狀態(tài)，水浴55℃、5 min即得總RNA。按照Promega Goscript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)說明書和北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司2×Taq PCR Green Mix說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)。
　　2、白芍總苷對CCl4肝損傷大鼠6種CYP450亞型酶的影響
　　健康Wistar大鼠30只，♂，體重(180～22

8、0)g，按體重隨機分為6組:正常對照組，模型對照組，TGP低、中、高劑量組、陽性對照組。每組5只，正常對照組與模型對照組給予純化水，TGP低、中、高劑量組分別灌胃給予TGP水溶液（劑量同1.1），陽性對照組給予聯(lián)苯雙酯滴丸水溶液0.2 g/kg體重，連續(xù)14天，除正常對照組大鼠注射等量生理鹽水外，其余各組均于末次給藥2h后，皮下注射50％CCl4玉米油溶液10mL/kg（CCl4∶玉米油=1∶1），16h后將大鼠斷頭處死（實驗前禁食16

9、h，自由飲水）。取血，分離血清測定ALT、AST;取肝，稱總重，計算肝臟系數(shù);肝左葉的相同部位用10％甲醛溶液固定，常規(guī)石臘包埋，HE染色，光鏡下觀察組織損傷程度;將剩余肝組織剪碎，洗凈血液，分裝于凍存管中，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白免疫印跡法測定TGP對CCl4肝損傷大鼠6種細(xì)胞色素P450亞型酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響，RT-PCR法測定TGP對CCl4

10、肝損傷大鼠六種CYP450亞型酶mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、白芍總苷對正常大鼠CYP450亞型酶的影響
　　與正常對照組相比，陽性對照組給予地塞米松能夠顯著上調(diào)CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及mRNA表達(dá)水平(P＜0.01)，TGP低、中、高劑量組較正常對照組均有增高趨勢，高劑量組能顯著增加CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及mRNA表達(dá)量(P＜0.01)。TGP對CYP2D6、C

11、YP2C9、CYP2C19蛋白及mRNA表達(dá)無明顯影響。
　　2、白芍總苷對急性CCl4肝損傷大鼠6種CYP450亞型酶的影響
　　2.1 TGP對急性CCl4肝損傷大鼠肝臟系數(shù)的影響
　　大鼠皮下注射CCl4后，模型組大鼠肝臟系數(shù)較正常對照組明顯上升，顯著高于正常對照組（P＜0.01）;與模型組比較，預(yù)先給予TGP或DDB能顯著降低肝損傷所致的肝臟系數(shù)上升(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2.2 TGP對C

12、Cl4所致大鼠急性肝損傷肝功能的影響
　　與正常對照組比較，模型組大鼠ALT、AST值明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，預(yù)先給予TGP或DDB能夠顯著降低ALT、AST水平(P＜0.05或P＜0.01)，且TGP陽性對照組和高劑量組效果明顯優(yōu)于TGP低、中劑量組。
　　2.3 TGP對CCl4所致大鼠急性肝損傷模型肝組織病理學(xué)觀察
　　正常對照組大鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，邊緣整齊，質(zhì)地柔軟;鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)完

13、整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞索清晰可辨。模型組大鼠肝臟體積腫大，呈土黃色，邊緣變鈍，質(zhì)脆;鏡下見肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞普遍變性，出現(xiàn)廣泛的肝細(xì)胞脂肪變性、空泡變性和彌散性的肝細(xì)胞壞死。TGP各給藥組和陽性對照組均能不同程度地改善上述病理改變，減輕腫脹、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等病理變化。
　　2.4 TGP對急性CCl4肝損傷大鼠CYP450亞型酶的影響
　　大鼠皮下注射CCl4后，與正常對照組相比，模型組CYP

14、3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.01);陽性對照組給予DDB明顯誘導(dǎo)CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及mRNA表達(dá)(P＜0.01); TGP低、中、高劑量組亦能增加CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)論:
　　1、TGP可誘導(dǎo)正常大鼠CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白和mRNA表達(dá)。
　　2、CCl4能顯著降低模型組大鼠CY