聯(lián)苯雙酯調(diào)控細(xì)胞色素P450同工酶保肝機(jī)制的研究.pdf

1、聯(lián)苯雙酯(bifendate,DDB)是合成五味子丙素的中間體之一,為我國首創(chuàng)的治療遷慢性肝炎藥物。實(shí)驗(yàn)表明,DDB不僅有明顯的降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)作用,對化學(xué)性肝臟損傷亦有明顯的保護(hù)作用。臨床上,該藥對病毒性肝炎病人ALT有迅速明顯的降低作用,為治療慢性肝炎的有效藥物,現(xiàn)已經(jīng)在肝病治療中廣泛應(yīng)用。 細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP)是肝藥酶中重要的酶系,主要存在于肝微粒體內(nèi),參與各種外源物(如藥

2、物、化學(xué)毒物、致癌物等)和內(nèi)源物(如類固醇激素、Vit.D、膽酸等)在體內(nèi)代謝過程。機(jī)體90％以上的藥物代謝都要通過肝微粒體酶的細(xì)胞色素P450,P450中現(xiàn)已知有70多種藥物代謝酶分別催化不同物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化,在藥物代謝和免疫中均起著相當(dāng)重要的作用。在藥物代謝過程中,往往存在一種CYP亞族參與多個(gè)藥物代謝、一種藥物由多個(gè)CYP亞族催化藥物的現(xiàn)象。同時(shí),許多藥物既是某種藥酶的底物,也可能是該種酶或其他酶的抑制劑和誘導(dǎo)劑,當(dāng)多種藥物聯(lián)合用藥

3、時(shí),有可能導(dǎo)致其中一種藥物發(fā)生代謝障礙或加快代謝速度,使發(fā)生毒副反應(yīng)或藥物無效。 近年來隨著細(xì)胞分離手段和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,對CYPP450的研究也已進(jìn)人分子水平。通過CYP的特性和表達(dá)分析,可以充分了解細(xì)胞色素P450在藥物代謝中的作用,從而闡明藥物的代謝機(jī)理和毒副反應(yīng)。 在CYP450的測定中,酶活性的測定、蛋白免疫測定和mRNA的測定是我們比較了解和熟悉的方法。在上述三種方法中,其中蛋白免疫測定中,需要特定

4、抗體；mRNA的測定中,如果蛋白的表達(dá)不完全依賴mRNA,那么用此方法測定的結(jié)果是不可靠的。酶活性的測定也會因?yàn)闃?biāo)記物質(zhì)的交叉反應(yīng),帶來不可信的結(jié)果。 隨著人類基因組序列圖繪制成功,生命科學(xué)進(jìn)入了后基因組時(shí)代。蛋白質(zhì)組(proteome)作為后基因計(jì)劃中的一個(gè)很重要內(nèi)容,已成為21世紀(jì)生命科學(xué)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。近年來,在大規(guī)模進(jìn)行蛋白質(zhì)組定性的基礎(chǔ)上,研究人員已經(jīng)將定量蛋白質(zhì)組學(xué)提上了重要日程。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究對于研究蛋白質(zhì)組的功能

5、、生命活動中蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及藥物靶標(biāo)、疾病診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展,定量蛋白質(zhì)組學(xué)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前,定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法包括兩類：一類是基于雙向電泳和圖像分析的技術(shù)策略,另一類是基于同位素標(biāo)記和質(zhì)譜的定量方法。為了挖掘CYP450在肝損傷前后以及在藥物治療肝損傷前后的變化,本課題用酸酐標(biāo)記技術(shù)與傅立葉轉(zhuǎn)換離子回旋共振質(zhì)譜(LTQ-FT)相結(jié)合,得到了一種新的定量蛋白質(zhì)研究技術(shù)

6、。通過建立的化學(xué)刺激(CCl4)肝損傷的動物模型,利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的同位素標(biāo)記法,比較處理前后的蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異、鑒定其中發(fā)生相應(yīng)變化的蛋白質(zhì),從而揭示了疾病標(biāo)記分子及藥物靶向作用的代謝酶。從蛋白質(zhì)分子水平上評價(jià)了聯(lián)苯雙酯對患病組織的修復(fù)治療作用,通過聯(lián)苯雙酯治療前后蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異,進(jìn)一步闡明該類保肝藥物的作用機(jī)理,為開發(fā)研究新藥提供有利的依據(jù)。 第一部分研究首先從方法學(xué)上建立了適用于肝微粒體樣品預(yù)處理方法,并優(yōu)化SDS

7、-PAGE分離蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解與提取方案。密度梯度離心提取肝微粒體,對SDS-PAGE分離膠上蛋白質(zhì)進(jìn)行還原、烷基化等處理,選擇適當(dāng)?shù)哪z上酶切方法,作為該平臺中聯(lián)系凝膠電泳分離和質(zhì)譜鑒定的橋梁,膠內(nèi)酶解過程是影響肽段回收率的主要因素。實(shí)驗(yàn)考察了對膠上酶解過程中嚴(yán)重影響肽段回收率和蛋白質(zhì)鑒定的確定性的諸多環(huán)節(jié),酶解時(shí)間的長短、是否去鹽等問題,優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)參數(shù)。酶解時(shí)間長(酶解過夜)有助于得到較多的肽段,膠上酶解所得的肽段是否去鹽對質(zhì)譜分析所

8、得的譜圖質(zhì)量的影響,主要取決于肽段溶液中含鹽量及溶液中肽段的相對多少等等。得到一種適用于分離CYP450蛋白質(zhì)的SDS-PAGE的方法。 第二部分將SDS-PAGE分離與肽段乙?；瘶?biāo)記有效結(jié)合起來,定量分析一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)組體系中的CYP450同工酶,彌補(bǔ)ICAT技術(shù)只針對含有巰基蛋白質(zhì)的定量分析的不足。所建立的酸酐標(biāo)記蛋白質(zhì)分析方法,將胍基化反應(yīng)與乙?；磻?yīng)相結(jié)合,提高了?；?建立了新的蛋白質(zhì)組同位素標(biāo)記定量方法。分析了

9、雄性大鼠肝微粒中CYP450同工酶。在CCL4刺激肝損傷的模型中共鑒定了17個(gè)CYP同工酶蛋白,定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),3個(gè)CYP450的同工酶表達(dá)上調(diào),3個(gè)CYP450的同工酶表達(dá)下調(diào)。在聯(lián)苯雙酯預(yù)防肝損傷的模型中,共鑒定出16個(gè)CYP同工酶,在16個(gè)CYP450同工酶蛋白中,1個(gè)CYP450的同工酶上調(diào),3個(gè)CYP450的同工酶蛋白下調(diào)。提示CCL4致肝臟肝細(xì)胞損傷與其中CYP2E1有直接的關(guān)系,同時(shí),聯(lián)苯雙酯的保肝降酶作用也與此酶有關(guān),并且