飛蝗細(xì)胞色素P450基因的分子特性及功能研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450基因是最龐大的超基因家族之一，存在于幾乎所有的生物體內(nèi)。在昆蟲體內(nèi)，細(xì)胞色素P450作為一種重要的代謝酶系，可以代謝多種殺蟲劑及植物次生代謝物質(zhì)。細(xì)胞色素P450功能的多樣性是由其基因的多樣性決定的。目前已有超過1000個昆蟲細(xì)胞色素P450基因被識別和鑒定，數(shù)目還在不斷增加。飛蝗是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲，對其生理生化、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)及有效控制等方面的研究具有重要意義。本文對飛蝗細(xì)胞色素P450基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從分子

2、水平揭示飛蝗不同家族細(xì)胞色素P450基因的組織、發(fā)育階段及殺蟲劑誘導(dǎo)表達(dá)特性，通過RNA干擾技術(shù)研究飛蝗細(xì)胞色素P450基因?qū)⑾x劑的代謝解毒機(jī)制，主要研究結(jié)果如下:
　　1、飛蝗細(xì)胞色素P450基因的搜索及其分子特性研究
　　采用生物信息學(xué)方法，根據(jù)昆蟲細(xì)胞色素P450的保守區(qū)(motif)，對飛蝗EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了全面搜索，并對獲得的細(xì)胞色素P450的ESTs進(jìn)行了拼接和注釋。獲得15個細(xì)胞色素P450基因片段，分別命名

3、為LmP450-1-15。采用RT-PCR檢測了15個細(xì)胞色素P450基因在五齡飛蝗不同組織部位和發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞色素P450基因主要在中腸、胃盲囊和脂肪體表達(dá)，少部分主要在馬氏管和后腸表達(dá)，極少數(shù)在前腸有明顯表達(dá);飛蝗細(xì)胞色素P450基因在三、四齡表達(dá)較高，而在卵這一階段相對表達(dá)較少。采用三種殺蟲劑（溴氰菊酯、馬拉硫磷和西維因）對三齡飛蝗進(jìn)行了劑量和時間依賴效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:三種殺蟲劑在不同濃度處理?xiàng)l件下，只有在溴

4、氰菊酯濃度為LD10和LD30分別引起細(xì)胞色素P450酶活性升高1.33倍和1.70倍，而用馬拉硫磷和西維因處理蟲體后，細(xì)胞色素P450酶活性沒有明顯的變化。溴氰菊酯處理三齡飛蝗12h，酶活性最高。進(jìn)一步研究點(diǎn)滴溴氰菊酯不同時間，細(xì)胞色素P450基因表達(dá)量的變化，結(jié)果表明:大多數(shù)基因在溴氰菊酯處理12h表達(dá)量最高，表明細(xì)胞色素P450酶活性的增高是由于基因表達(dá)量增加的結(jié)果。
　　2、飛蝗細(xì)胞色素P450基因全長序列克隆
　　

5、通過RACE-PCR方法，對15個飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段進(jìn)行5'和3'-RACE擴(kuò)增，獲得2個細(xì)胞色素P450基因全長序列，由細(xì)胞色素P450國際命名委員會分別命名為CYP409A1和CYP408B1，并確定為兩個新家族基因。采用生物信息學(xué)方法對飛蝗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了全面搜索，并對獲得的細(xì)胞色素P450基因序列進(jìn)行克隆，共獲得6個細(xì)胞色素P450基因全長序列，由細(xì)胞色素P450國際命名委員會分別命名為CYP6FD1、CYP6FD

6、2、CYP6FE1、CYP6FF1、CYP6FG1和CYP9AQ2。
　　將8個飛蝗細(xì)胞色素P450氨基酸序列與果蠅的細(xì)胞色素P450s進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示，除CYP409A1和CYP408B1兩個新家族成員外，其它各家族基因均與果蠅的同一家族成員聚為一簇。8個飛蝗細(xì)胞色素P450基因均屬于CYP3族(Clan)的成員，該族成員與藥物及外源物質(zhì)的代謝相關(guān)。
　　3、飛蝗細(xì)胞色素P450基因的發(fā)育階段及組織特異表達(dá)
　　采

7、用Real-timePCR技術(shù)檢測了8個飛蝗細(xì)胞色素P450基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CYP409A1、CYP6FG1和CYP9AQ2三個基因在卵階段mRNA的表達(dá)與其它發(fā)育階段相比表達(dá)量較低。而CYP6FD1、CYP6FD2和CYP6FE1在卵階段幾乎沒有表達(dá)，CYP6FD1在四齡表達(dá)最高，一齡到三齡次之;CYP6FD2表達(dá)較為特殊，僅在成蟲期高表達(dá);CYP6FE1在四齡表達(dá)量最高，五齡和成蟲次之。CYP408B1和CYP6FF1

8、在飛蝗各個發(fā)育階段均有表達(dá)。
　　采用Real-timePCR技術(shù)檢測了8個飛蝗細(xì)胞色素P450基因在飛蝗五齡若蟲不同組織部位的表達(dá)，結(jié)果顯示:CYP409A1在所有組織中都有表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)弱有所不同，馬氏管表達(dá)量最高，胃盲囊和脂肪體表達(dá)量次之，血淋巴和肌肉中表達(dá)量最低。CYP408B1在前腸高表達(dá)，后腸、脂肪體、肌肉和腦中也有一定的表達(dá)。除血淋巴外，CYP9AQ2在其余組織部位均有較高的表達(dá)，前腸表達(dá)量最高。CYP6家族的5個基

9、因在脂肪體或馬氏管表達(dá)量最高。
　　4、溴氰菊酯對飛蝗細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)
　　采用Real-timePCR對不同濃度溴氰菊酯處理飛蝗后細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:CYP409A1、CYP6FD2、CYP6FF1和CYP6FG1均表現(xiàn)為低劑量誘導(dǎo)的趨勢，與對照相比，在溴氰菊酯LD10劑量下，其mRNA表達(dá)量提高了1.7-2.0倍。CYP9AQ2在溴氰菊酯三個劑量作用下都有高表達(dá)，為對照的2.26

10、-2.55倍。CYP408B1和CYP6FE1的表達(dá)情況在溴氰菊酯處理前后沒有顯著的變化。只有CYP6FD1基因mRNA的表達(dá)受到抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，隨著濃度的增加mRNA表達(dá)量逐漸下降。
　　采用溴氰菊酯處理飛蝗4、8、12、24和48h，除CYP408B1和CYP6FD1外，大多數(shù)細(xì)胞色素P450基因在溴氰菊酯處理后表現(xiàn)出不同程度的誘導(dǎo)作用，在溴氰菊酯處理飛蝗12h其誘導(dǎo)表達(dá)量與同一時間點(diǎn)對照相比可達(dá)1.2-6.7倍。C

11、YP408B1和CYP6FD1經(jīng)溴氰菊酯處理不同時間后其mRNA表達(dá)呈現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象，前者在48h表達(dá)量最低，后者在8h表現(xiàn)出最低的表達(dá)量。
　　5、基于RNAi的飛蝗細(xì)胞色素P450基因功能研究
　　本研究發(fā)現(xiàn)在分別注射CYP409A1、CYP408B1、CYP6FF1和CYP9AQ2等4個細(xì)胞色素P450基因dsRNA后點(diǎn)滴溴氰菊酯，與注射dsGFP后點(diǎn)滴溴氰菊酯相比，飛蝗的死亡率明顯提高，表明這4個基因在飛蝗對溴氰菊酯

12、的代謝中起著關(guān)鍵作用。分別注射CYP6FD2和CYP6FE1基因dsRNA后點(diǎn)滴西維因，與注射dsGFP的對照相比，飛蝗的死亡率明顯提高，表明CYP6FD2和CYP6FE1基因可能參與飛蝗對西維因的代謝。分別注射8個細(xì)胞色素P450基因特異dsRNA后點(diǎn)滴馬拉硫磷或DDT，與注射dsGFP的對照相比，飛蝗的死亡率均未見顯著性差異，表明本研究中獲得的8個細(xì)胞色素P450全長基因可能并不涉及馬拉硫磷或DDT的代謝。
　　6、飛蝗細(xì)胞色

13、素P450基因的原核表達(dá)
　　本研究試圖以CYP409A1和CYP408B1為例，建立飛蝗細(xì)胞色素P450基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果表明:我們成功構(gòu)建了pET28a-CYP409A1和pET28a-CYP408B1兩種重組蛋白。但遺憾的是對兩種重組蛋白在大腸桿菌宿主細(xì)胞中未獲表達(dá)。
　　綜上所述，本研究基于飛蝗EST數(shù)據(jù)庫平臺獲得15個細(xì)胞色素P450基因片段，并進(jìn)行了初步的分子特性研究，為進(jìn)一步研究飛蝗細(xì)胞色素P450提供

14、了新的資料;通過克隆獲得8個飛蝗細(xì)胞色素P450基因全長序列，為深入研究飛蝗細(xì)胞色素P450基因結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ);采用Real-timePCR技術(shù)系統(tǒng)分析了8個細(xì)胞色素P450基因在飛蝗不同發(fā)育階段、不同組織部位及溴氰菊酯誘導(dǎo)下的表達(dá)特性，并基于RNAi探討了飛蝗細(xì)胞色素P450基因與殺蟲劑代謝的關(guān)系;另外，還初步進(jìn)行了飛蝗細(xì)胞色素P450基因的大腸桿菌表達(dá)研究。研究結(jié)果將為進(jìn)一步開展飛蝗細(xì)胞色素P450的生物學(xué)功能和生理生化特性提