荷葉生物堿單體的分離純化及其對3T3-L1前脂肪細胞作用的構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、荷葉(Lotus leaf)是睡蓮科植物蓮的葉，在我國的分布十分廣泛。荷葉中含有大量的生物活性成分如生物堿、黃酮、β-胡蘿卜素、多糖、有機酸、揮發(fā)性油類、甾體、皂類等，擁有抑菌、抗氧化、抗病毒和降脂減肥等作用，因而受到人們的廣泛關(guān)注。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，目前關(guān)于荷葉降脂減肥作用的研究主要集中于荷葉生物堿粗提物對高脂血癥大鼠的作用研究，而關(guān)于荷葉提取物對3T3-L1前脂肪細胞作用的報道較少，荷葉生物堿單體對3T3-L1前脂肪細胞的作用及其構(gòu)

2、效關(guān)系則未見報道。隨著人們生活水平的提高，肥胖尤其是肥胖兒童的增多，越來越引起人們的關(guān)注，因此開發(fā)出綠色、健康的降脂減肥食品或藥物具有極其重要的現(xiàn)實意義。本文以荷葉為對象，研究荷葉生物堿提取物及其單體對3T3-L1前脂肪細胞的增殖、周期、凋亡以及分化的作用，并進一步探索荷葉生物堿發(fā)揮預(yù)防肥胖作用的有效成分，研究結(jié)果可為天然降脂減肥食品或藥物的開發(fā)提供依據(jù)。得到研究結(jié)果如下:
　　(1)采用酸性乙醇溶液超聲提取法，得到荷葉生物堿粗提

3、物，并將其作用于3T3-L1前脂肪細胞，測定其對細胞增殖、周期、凋亡以及分化的相關(guān)作用。研究結(jié)果表明，荷葉生物堿粗提物能有效地抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖，并呈劑量時間依賴效應(yīng)，作用于3T3-L1前脂肪細胞24 h、48 h、72 h的IC50值分別為171μg/mL、153μg/mL、129μg/mL，作用效果顯著。荷葉生物堿粗提物能顯著作用3T3-L1前脂肪細胞的周期，并將其阻滯于G0/G1期，從而能顯著抑制細胞增殖。PI/An

4、nexinⅤ-FITC雙染結(jié)果顯示荷葉生物堿粗提物能誘導3T3-L1前脂肪細胞的凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性。在加入荷葉生物堿提取物后，3T3-L1前脂肪細胞的分化受到了不同程度的抑制，且隨著加入濃度的升高，抑制作用也隨之增強，當作用濃度為100μ g/mL時，前脂肪細胞的分化OD值下降了36.7％，具有顯著性差異。
　　(2)采用制備型高效液相色譜分離制備得到了6種荷葉生物堿單體，通過質(zhì)譜、薄層色譜、紫外光譜以及分析型高效液相色譜鑒定

5、，并對照文獻推測可能為原荷葉堿、亞美罌粟堿、巴婆堿、O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿，純度分別為91.9％、93.8％、83.5％、96.7％、91.8％、94.2％。首先使用制備型高效液相色譜進行荷葉生物堿的分離，制備條件為流動相乙腈和0.05％氨水配比為48∶52，進樣濃度為10 mg/mL，進樣量2mL/次，流動相流速為8 mL/min，檢測波長為270 nm。在此條件下，分離制備得到4種荷葉生物堿單體，分別為巴婆堿、O

6、-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿，再通過二次制備，條件為流動相乙腈和0.05％氨水配比為28∶72，進樣濃度為10 mg/mL，進樣量2 mL/次，流動相流速為8 mL/min，檢測波長為270 nm，在此條件下分離得到原荷葉堿和亞美罌粟。
　　(3)將分離純化得到的6種荷葉生物堿單體分別作用于3T3-L1前脂肪細胞，測定其對3T3-L1前脂肪細胞的增殖、周期、凋亡以及分化的相關(guān)作用，并進一步分析其構(gòu)效關(guān)系。研究結(jié)果表明，

7、6種生物堿單體對細胞增殖的抑制效果為N-去甲基荷葉堿＞巴婆堿＞O-去甲基荷葉堿＞荷葉堿，而原荷葉堿和亞美罌粟堿幾乎沒有抑制效果。對細胞周期的影響研究表明，巴婆堿將細胞阻滯于G2/M期，O-去甲基荷葉堿將細胞阻滯于G0/G1期，N-去甲基荷葉堿與荷葉堿均將細胞阻滯于S期。通過比較4種單體的促細胞凋亡作用，得到其作用效果由高到低為N-去甲基荷葉堿、巴婆堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿，其作用效果基本與細胞的增殖抑制相類似。比較荷葉堿與N-去甲基