羅格列酮對(duì)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激所致小鼠抑郁癥的治療作用及機(jī)制.pdf

1、抑郁癥(depression)是心境障礙的一種，其主要臨床特征是心境低落、思維遲緩、認(rèn)知功能損害、意志活動(dòng)減退和軀體癥狀。據(jù)WHO最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球抑郁癥患病率高達(dá)12.8％，并預(yù)測2020年抑郁癥將成為全球第二位醫(yī)療疾患。目前臨床常用的抗抑郁藥治療作用有限，并且副作用明顯。因此，尋求安全可靠且治療效果顯著的抗抑郁藥迫在眉睫。
　　抑郁癥患者中常出現(xiàn)前額葉-邊緣系統(tǒng)的葡萄糖低代謝特征，提示能量代謝損傷可能都是抑郁癥臨床癥狀產(chǎn)

2、生的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。除此之外，抑郁癥和代謝性疾病還存在很多共同的病理特征，如血糖代謝失衡、慢性炎癥反應(yīng)、神經(jīng)-內(nèi)分泌紊亂等。因此，抑郁癥與代謝性疾病有著十分密切的關(guān)系。
　　羅格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinedione，TZD)，臨床上作為胰島素增敏劑用于治療2型糖尿病。越來越多的研究證實(shí)羅格列酮對(duì)包括腦卒中、阿爾茨海默病在內(nèi)的多種神經(jīng)精神類疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用。但是，羅格列酮在抑郁癥中的作用及機(jī)制尚不清楚。本

3、文從在體（慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激所致抑郁癥模型小鼠）和離體（皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞模型）水平評(píng)價(jià)羅格列酮對(duì)抑郁癥的潛在治療作用及機(jī)制。研究結(jié)果將為抑郁癥治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　研究、闡明羅格列酮對(duì)抑郁癥模型小鼠的實(shí)驗(yàn)性治療作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.應(yīng)用糖水偏愛測試(sucrose preference test，SPT)、強(qiáng)迫游泳(forcedswimming test，F(xiàn)ST)和開場(

4、open field test，OFT)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)小鼠CMS模型及羅格列酮對(duì)抑郁樣行為的影響。
　　2.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence，IF)檢測前額葉皮層和海馬石蠟切片中NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞和CD11b標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附法(enz

5、yme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測動(dòng)物血清中IL-6、TNFα、IGF1、VEGF、CNTF的濃度
　　4.培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及N2a細(xì)胞系，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)(immuno cytochemistry，ICC)染色結(jié)合體視學(xué)技術(shù)，檢測細(xì)胞陽性率。
　　5.用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)或者乳酸脫氫酶(lactic

6、dehydrogenase，LDH)法檢測細(xì)胞活力。
　　6.透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察細(xì)胞自噬小體的形成及數(shù)量。
　　7.采用Annexin-Ⅴ和PI對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行雙染，并用流式細(xì)胞分選儀檢測原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率。
　　8.應(yīng)用免疫印跡法(western blotting，WB)檢測動(dòng)物組織及細(xì)胞樣本中自噬相關(guān)蛋白LC3、AMPK、P62、ULK1

7、及凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax、Bcl-2、PARP的表達(dá)情況。
　　9.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(real-time quantification polymerase chainreaction，RT-qPCR)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PPARγ的效率及細(xì)胞因子和STRAD、MO25的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.羅格列酮改善CMS引起的小鼠抑郁樣行為
　　羅格列酮（5 mg/ml）能升高CMS模型小鼠的

8、糖水偏愛率，并使其平均體重增加3.7 g;與CMS組小鼠相比，羅格列酮能顯著增加小鼠在FST中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，延長小鼠在OFT中的中心停留時(shí)間。
　　2.羅格列酮能緩解CMS引起的前額葉皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，并增強(qiáng)海馬區(qū)的神經(jīng)再生能力
　　應(yīng)用TUNEL染色顯示，羅格列酮能減少皮層細(xì)胞的凋亡;通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能夠增加CMS小鼠前額葉皮層中星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，并改善神經(jīng)元軸突的密度。同時(shí)，羅格列酮增加海馬CA

9、1區(qū)中Ki67標(biāo)記的新生神經(jīng)元數(shù)目，表明羅格列酮具有改善抑郁癥小鼠神經(jīng)再生的作用。
　　3.羅格列酮能抑制小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，改善細(xì)胞因子分泌的紊亂
　　通過qPCR和ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CMS造模導(dǎo)致小鼠血清和前額葉皮層中IL-1β、IL-6、TNFα的濃度及mRNA水平升高，而羅格列酮能逆轉(zhuǎn)這些炎癥因子的升高趨勢;羅格列酮還能增加血清中CNTF和IGF1的濃度;使血清中皮質(zhì)酮的濃度下降至366 ng/ml（CMS組為71

10、3 ng/ml）。
　　4.羅格列酮上調(diào)前額葉皮層神經(jīng)元自噬水平并抑制凋亡
　　羅格列酮使自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、ULK1、Beclin1及p-AMPK/AMPK表達(dá)升高，而降低P62的表達(dá)。隨后的免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CMS組相比，羅格列酮使NeuN標(biāo)記陽性神經(jīng)元中LC3B的表達(dá)升高約68％。另外，羅格列酮促進(jìn)Bcl-2/Bax、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt和p-IRS1/IRS1等蛋白表達(dá)。
　　5.

11、羅格列酮通過激活LKB1/AMPK通路，促進(jìn)原代皮層神經(jīng)元和N2a細(xì)胞的自噬
　　皮質(zhì)酮(10μM)刺激導(dǎo)致原代皮層神經(jīng)元和N2a細(xì)胞活力降低，而羅格利酮給藥可以對(duì)抗皮質(zhì)酮所致細(xì)胞的損傷。應(yīng)用透射電鏡觀察結(jié)果顯示，羅格列酮能增加自噬小體的形成;進(jìn)一步對(duì)自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3、ULK1、P62等表達(dá)的分析表明，羅格列酮能逆轉(zhuǎn)CMS引起的自噬水平降低。羅格列酮所引起的上述改變均可被PPARγ拮抗劑T0070907阻斷;敲低和過表

12、達(dá)PPARγ表達(dá)后，羅格列酮能明顯降低或升高LKB1、STRAD、MO25的表達(dá)，從而影響羅格列酮對(duì)N2a細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。這些結(jié)果提示，羅格列酮作用于PPARγ、激活LKB1/AMPK通路，從而促進(jìn)神經(jīng)元自噬，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。
　　6.羅格列酮通過增加IGF1R的表達(dá)、激活A(yù)kt/CREB通路，抑制皮質(zhì)酮所致星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測AV/PI雙染細(xì)胞、WB分析Bcl-2/Bax、caspase3、PA

13、RPp85等蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:羅格列酮具有抗凋亡作用。IGF1R在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯高于神經(jīng)元;羅格列酮增加IGF1R及其底物IRS1的磷酸化表達(dá)（分別增加約175％和86％），促進(jìn)下游Akt、CREB的磷酸化，進(jìn)而起到保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的做用。
　　7.羅格列酮改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而保護(hù)皮層神經(jīng)元
　　應(yīng)用皮質(zhì)酮和羅格列酮處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元，結(jié)果顯示條件培養(yǎng)基能

14、對(duì)抗皮質(zhì)酮所致神經(jīng)元損傷、使細(xì)胞活力增加49％，同時(shí)細(xì)胞核皺縮的神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。應(yīng)用MAP2熒光探針標(biāo)記條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基具有促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長的作用。
　　結(jié)論:
　　羅格列酮通過促進(jìn)神經(jīng)元自噬、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。
　　本文工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處:
　　1.發(fā)現(xiàn)羅格列酮能減輕CMS和皮質(zhì)酮所致神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用，為將其發(fā)展為抑郁癥藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);