羅格列酮對OLETF鼠糖尿病發(fā)病的干預及作用機制的研究——羅格列酮對OLETF鼠胰島β細胞凋亡的影響.pdf

1、【背景】糖尿病發(fā)病率逐年上升，成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴重危害人類健康的疾病。全球目前有超過1.5億糖尿病患者，預測到2025年這一數(shù)字將會翻一番。近年來，盡管在糖尿病治療領域取得了不斷的進步，但臨床上仍然缺乏有效的手段控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與進展。預防糖尿病的發(fā)生，從根本上消除糖尿病帶來的危害，成為最受人們關注的問題之一。 在全部糖尿病患者中，90％以上是2型糖尿病患者。幾乎所有2型糖尿病都要經過糖耐量異常(im

2、pairedglucosetolerance，IGT)階段。IGT是介于正常和2型糖尿病的過渡階段。目前認為，IGT患者經過合理的干預治療，有相當部分患者可使餐后2小時血糖恢復到正常水平，但如果不進行干預治療，則每年以10％～15％的自然轉歸率發(fā)展為2型糖尿病。目前國內外普遍認為，對IGT人群進行干預，是預防2型糖尿病發(fā)生的最有針對性和經費開支最合理的人群。 研究表明，占人類糖尿病患者90％以上的2型糖尿病是可以預防的，且有效的

3、干預可以降低2型糖尿病發(fā)病危險31％～58％。 藥物干預是目前糖尿病預防的重要手段之一。目前2型糖尿病的干預藥物主要包括二甲雙胍、α-糖苷酶抑制劑和胰島素增敏劑。其中TRIPOD和DPP研究顯示，胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(TZDs)不僅能預防糖尿病的發(fā)生，而且與其它干預藥物相比，能更有效地降低2型糖尿病的發(fā)生率。以TZDs羅格列酮(rosiglitazone)為研究對象之一的大規(guī)模前瞻性糖尿病預防研究(DREAM)也已經進行

4、。這表明，TZDs可能是一類非常有前途的糖尿病干預藥物。羅格列酮作為TZDs中新開發(fā)的一種副作用較小的藥物，在2型糖尿病干預中可能發(fā)揮更重要的作用。闡明羅格列酮預防糖尿病的機制對更好地利用TZDs尤其是羅格列酮進行糖尿病的防治工作是非常必要的。 2型糖尿病的發(fā)病機制尚未完全闡明。目前認為胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病最重要的兩個發(fā)病因素。胰島β細胞功能受損作為兩個重要的發(fā)病環(huán)節(jié)之一，在近年來受到越來越多的重視，甚至有

5、觀點認為胰島β細胞功能受損相對于胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)病過程中可能起著更為重要的作用。英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)顯示，β細胞功能受損可以導致2型糖尿病患者血糖控制上的惡化。既往研究表明，細胞凋亡是2型糖尿病β細胞數(shù)量減少的主要原因，凋亡引起的胰島β細胞數(shù)量的減少足以導致高血糖。 本研究將采用目前國際上公認的優(yōu)秀自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF(OtsukaLong-EvansTokushimaFatty)鼠及其同系

6、非糖尿病對照鼠LETO(Long-EvansTokushimaOtsuka)鼠作為研究對象，用羅格列酮進行干預，觀察該藥對2型糖尿病的預防作用，并探討羅格列酮對胰島β細胞凋亡的作用與可能機制。 研究分以下二部分進行： 第一章羅格列酮對OLETF鼠糖尿病發(fā)病的干預作用 【目的】探討羅格列酮對自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠糖尿病發(fā)病的干預作用。 【方法】1.以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系

7、非糖尿病對照鼠LETO鼠為實驗對象。大鼠皆為雄性，共分三組。OLETF鼠羅格列酮干預組(干預組)和OLETF鼠對照組(對照組)，每組20只；LETO鼠10只作為正常對照組(LETO組)。從8周齡開始，干預組予羅格列酮溶液灌胃(3mg·kg-1d-1)，其余兩組以等量蒸餾水灌胃。 2.定期行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。試驗前隔夜禁食15小時、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃。 3.監(jiān)測各組大鼠攝食及體重增長情

8、況，每周稱量大鼠體重和攝食量一次。 Ⅲ4.實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩樣本計量資料比較采用t檢驗。多組間資料比較用單因素方差分析(ANOVA)檢驗。糖尿病發(fā)病率組間比較用X2檢驗。檢驗標準α定為0.05。 【結果】1.干預組和對照組攝食量各周齡均顯著高于LETO組(p＜0.01)。干預組攝食量與對照組相比在各周齡均無顯著性差異(p＞0.05)。 2.23周

9、齡對照組負荷后2h血糖(2hPG)較前升高(10.1±1.8mmol/L)，顯著高于13周齡和18周齡血糖(8.2±0.9，6.7±0.9mmol/L)(p＜0.01)，并隨周齡進一步升高(40周齡14.8±3.2mmol/L)。 3.對照組在23周齡出現(xiàn)4例糖耐量異常、1例糖尿病。40周齡時，糖尿病發(fā)病率為92.9％；干預組在30周齡有1例糖耐量異常，40周齡時糖尿病發(fā)病率為6.7％。干預組的發(fā)病率顯著低于同時期對照組(p＜0

10、.01)。LETO組無IGT或糖尿病發(fā)生。 4.干預組血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素顯著低于對照組(p＜0.05)。 【結論】 1.羅格列酮能夠顯著降低OLETF鼠血糖升高程度，延緩高血糖的出現(xiàn)； 2.羅格列酮可顯著降低OLETF鼠2型糖尿病的發(fā)病率，有效預防糖尿病的發(fā)生； 3.羅格列酮能夠顯著降低血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素水平。 第二章羅格列酮對O

11、LETF鼠胰島β細胞凋亡的影響 【目的】通過對羅格列酮干預的OLETF鼠及其對照組胰島β細胞凋亡水平和凋亡相關因素的觀察，對羅格列酮抑制胰島β細胞凋亡的作用和可能機制進行初步探討。 【方法】1.分別于8、32和40周齡隨機處死大鼠。大鼠宰殺后分離胰腺，濾紙吸干水份稱重?？v向分離并分置于4％多聚甲醛、液氮和3％戊二醛中待檢。 2.以石蠟切片機間隔4μm連續(xù)切片。相鄰切片分別用標準HE染色觀察組織學改變、用免疫組化標

12、記胰島β細胞、TUNEL+免疫組化法標記凋亡的胰島β細胞，免疫組化法染色Bcl-2陽性細胞。同時計算凋亡的β細胞百分數(shù)。每只鼠至少計數(shù)20個胰島。凋亡的β細胞百分數(shù)=(凋亡β細胞數(shù)/總β細胞數(shù))×100％。 3.記數(shù)Bcl-2陽性細胞數(shù)：免疫組化切片中，細胞膜和細胞漿呈棕黃色至深棕黃色者為陽性細胞。肉眼計數(shù)陽性細胞數(shù)，每只鼠至少計數(shù)20個胰島，并計算陽性率。陽性率=(陽性細胞數(shù)/總β細胞數(shù))×100％。 4.電子顯微鏡觀

13、察胰島β細胞形態(tài)。 5.取液氮中的胰腺標本，提取總RNA，以半定量RT-PCR技術擴增凋亡相關基因Bcl-2和Bax，凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結果，檢測各條帶輝度，并計算特異條帶與內參照GAPDH條帶的輝度比值。觀察其在基因轉錄水平上的表達差異。 Ⅴ6.統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。 【結果】1.各組大鼠胰腺重量隨周齡延長有逐漸增加的趨勢。但不同周齡大鼠

14、自身比較及相同周齡各組大鼠間胰腺重量均無顯著性差異(P＞0.05)。各組8周齡和32周齡胰腺/體重％無顯著性差異(p＞0.05)，40周齡LETO組顯著高于干預組和對照組(p＜0.01)。 2.8周齡時各組大鼠胰島結構無明顯差別。32周齡，干預組和對照組胰島與LETO組相比明顯肥大，有纖維組織長入。對照組大鼠胰島纖維化更嚴重，結構不整齊。40周齡時，對照組大鼠胰島形狀更不規(guī)則，纖維組織大量增生，多數(shù)胰島失去正常結構，可見胰島明顯

15、萎縮。干預組大鼠胰島仍保留基本形態(tài)，無明顯萎縮。部分胰島有腺泡侵入或有明顯的纖維化。 3.電鏡下可見對照組凋亡的胰島β細胞染色質邊集、胞核縮小濃染，出現(xiàn)核固縮。胞質內細胞器萎縮、分泌顆粒數(shù)量減少。干預組非凋亡的胰島β細胞可見細胞器腫脹。 4.LETO組胰島β細胞凋亡率在8、32、40周齡分別為0.08±0.03％、0.12±0.03％、0.12±0.04％；對照組為0.22±0.02％、0.28±0.03％、0.26±0

16、.03％；干預組32和40周齡為0.18±0.02％、0.17±0.04％。32和40周齡干預組胰島β細胞凋亡率顯著低于對照組(p＜0.01)。 5.LETO組Bcl-2陽性細胞百分率在8、32、40周齡分別為68.45±21.3％、52.76±12.8％、53.01±11.3％；對照組為50.92±9.4％、36.93±1.4％、33.12±7.1％；干預組32周齡和40周齡為59.60±9.9％、55.24±9.7％。

17、 6.各組Bcl-2mRNA表達水平都隨周齡增加而降低，但這種變化無顯著性差異Ⅵ(p＞0.05)。同周齡各組間的橫向比較，在32周齡LETO組表達水平最高，干預組次之，對照組最低，但差異不具有顯著性(p＞0.05)。 【結論】1.OLETF鼠胰島β細胞在糖尿病發(fā)生前即有高水平凋亡出現(xiàn)，隨病程進展，凋亡水平進一步增高。 2.羅格列酮能顯著降低胰島β細胞凋亡水平，保護胰島的正常結構和功能，這可能是其延緩、預防糖尿病發(fā)生的機