羅格列酮對(duì)2型糖尿病小鼠肌肉萎縮拮抗機(jī)制.pdf

1、目的:了解單純性2型糖尿病(胰島素抵抗)是否會(huì)出現(xiàn)肌肉萎縮，探討導(dǎo)致2型糖尿病肌肉萎縮的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.動(dòng)物:采用2型糖尿病基因模型小鼠(BKS.Cg-m+/+Lepr)作為實(shí)驗(yàn)組，同窩出生的野生型小鼠為對(duì)照組(C57BLKS/J)，每組12只雄性小鼠，均為出生四周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均購(gòu)自Jackson Laboratories(Bar Harbor，MEUSA)。對(duì)四周大小的實(shí)驗(yàn)

2、組和對(duì)照組小鼠進(jìn)行稱重，然后均以12h亮、12h暗的周期飼養(yǎng)。在另一組試驗(yàn)中，一組對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，另一組在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組飼料中均加入馬來(lái)酸羅格列酮飼養(yǎng)(8mg/kg/d)。
　　 2.在第9周時(shí)再對(duì)兩組小鼠進(jìn)行稱重、測(cè)量身長(zhǎng)，并采用從心臟采血的方法采集血樣，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的血漿胰島素和血糖。之后將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠麻醉，取比目魚肌、伸趾長(zhǎng)肌、跖肌和心肌進(jìn)行稱重，并分別測(cè)定兩組小鼠肌肉蛋白質(zhì)降解速率、肌動(dòng)

3、蛋白降解片段、肌纖維橫斷面面積以及蛋白酶體活性。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng):將小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞3-10代的細(xì)胞置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間依次采用標(biāo)準(zhǔn)DMEM(CA)培養(yǎng)基，含10％小牛血清(UT)、青霉素(200 U/ml)和鏈霉素(200μg/ml)，培養(yǎng)2天；依次放在含lμM地塞米松，10μg/ml胰島素和0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma-Aldrich)的誘導(dǎo)分化細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天；放在

4、含10％胰島素的分化后培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5天，這時(shí)細(xì)胞形態(tài)上呈現(xiàn)高分化型。之后，細(xì)胞再次于DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天。接下來(lái)，將細(xì)胞放在含10μg/ml羅格列酮(MI)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，然后收集細(xì)胞，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，包括：脂聯(lián)素mRNA、腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白介素6(IL-6)的mRNA表達(dá)水平。
　　 4.Real-time PCR用Trizo1RNA提取試劑(Invitrogen)從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腓腸肌和不同分化

5、形態(tài)的3T3-L1小鼠細(xì)胞提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后。Real-time PCR用SYBR GreenPCR試劑(Bio-Rad，Hercules，CA)、the Opticon DNA儀器(Bio-Rad)和下面的循環(huán)參數(shù)：94℃2分鐘，94℃15秒40個(gè)循環(huán)，55℃30秒，72℃30秒，最后72℃10分鐘。加入引物小鼠泛素連接酶、MuRF-1、甘油醛-3磷酸脫氫酶進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定GAPDH基因和檢出值mRNA的表達(dá)之間的差異。
　

6、　 5.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，不同處理組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.在實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重與對(duì)照組小鼠體重沒(méi)有明顯差別；但在第9周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重、血糖、血漿胰島素水平與對(duì)照組小鼠比較均有明顯增加且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二者之間BMI

7、差異有顯著性。
　　 2.在第9周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠比目魚肌、伸趾長(zhǎng)肌、跖肌肌肉重量與對(duì)照組相比均有明顯下降且差異具有顯著性意義。
　　 3.實(shí)驗(yàn)組小鼠腓腸肌肌纖維橫切面面積顯著小于對(duì)照組且差異具有顯著性意義。
　　 4.實(shí)驗(yàn)組小鼠腓腸肌14-Kda的肌動(dòng)蛋白片段密度顯著高于對(duì)照組。
　　 5.實(shí)驗(yàn)組小鼠比目魚肌、伸趾長(zhǎng)肌、跖肌的蛋白質(zhì)降解速率顯著高于對(duì)照組。
　　 6.實(shí)驗(yàn)組小鼠腓腸肌中的蛋白體酶活性

8、顯著高于對(duì)照組。
　　 7.2型糖尿小鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3 Knase)活性顯著降低，同時(shí)胰島素受體1磷酸化絲氨酸307激酶(pIRS1-ser307)活性顯著升高，Akt磷酸化絲氨酸473(pIRS1-ser473)活性降低，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 8.2型糖尿病小鼠和野生型小鼠均加喂馬來(lái)酸羅格列酮飼養(yǎng)35天后，2型糖尿病小鼠血糖、血漿胰島素水平均下降到野生型水平，高血糖癥、高胰島素血癥均得到糾正；

9、但其體重沒(méi)有明顯變化。
　　 9.2型糖尿小鼠和野生型小鼠均加喂馬來(lái)酸羅格列酮飼養(yǎng)35天后，2型糖尿小鼠與未加喂羅格列酮的2型糖尿小鼠相比：糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮的含量顯著降低；二者相比，血漿脂聯(lián)素水平明顯升高。
　　 10.2型糖尿病小鼠和野生型小鼠均加喂馬來(lái)酸羅格列酮飼養(yǎng)35天后，PI3K活性增加；IRS-1磷酸化的絲氨酸307(pIRS1-ser307)活性降低、Akt磷酸化的絲氨酸473(pAkt-ser473)活性升

10、高。
　　 11.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后，加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后的2型糖尿小鼠蛋白酶體活性與未喂加羅格列酮飼養(yǎng)的2型糖尿小鼠相比顯著降低(n=4，t=6.609，P<0.005)；加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后2型糖尿小鼠目魚肌、伸趾長(zhǎng)肌、跖肌蛋白質(zhì)分解速率較未加喂羅格列酮均顯著降低((n=4，t=2.461，P<0.05(比目魚肌)；t=4.401，P<0.05(伸趾長(zhǎng)肌)；t=2.718，P<0.05(跖肌))

11、。
　　 12.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中加羅格列酮后，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平增加，同時(shí)腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白介素6(IL-6)的mRNA表達(dá)水平降低。
　　 13.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均加喂羅格列酮飼養(yǎng)35天后，加喂羅格列酮飼養(yǎng)后的2型糖尿小鼠蛋白酶體活性磷脂酰肌醇-3激酶活性升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肌肉中FOXO1轉(zhuǎn)錄因子水平降低、FOXO1轉(zhuǎn)錄因子磷酸化水平升高，肌肉中磷酸化FOXO1轉(zhuǎn)錄因子與FOXO1轉(zhuǎn)錄因子

12、比值升高；肌肉萎縮因子、肌肉環(huán)狀指基因1mRNA表達(dá)水平下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.2型糖尿病小鼠肌肉蛋白質(zhì)降解增加，存在嚴(yán)重的肌肉萎縮。
　　 2.2型糖尿病小鼠泛素-蛋白酶體蛋白質(zhì)水解途徑的被激活，從而使蛋白質(zhì)降解增加，可能是導(dǎo)致肌肉萎縮的機(jī)制之一，尚有待進(jìn)一步深入探討。
　　 3.2型糖尿病小鼠PI3K/Akt細(xì)胞通路受損，引起胰島素抵抗，也可能是導(dǎo)致肌肉萎縮的機(jī)制之一。
　　 4.羅格