農(nóng)杜菌介導(dǎo)無(wú)標(biāo)記耐鹽基因水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立.pdf

1、全世界鹽堿地面積約占世界總耕地面積的20％。由于干旱，不合理的灌溉以及化肥的過(guò)度使用，工業(yè)污染加劇，土壤鹽堿化正不斷擴(kuò)大，可供耕種的土地面積正日趨減少。水稻是世界1/3人口的主食，但一直處于供不應(yīng)求的狀況，因此，提高水稻產(chǎn)量，改良稻米品質(zhì)關(guān)系到人類的生存和發(fā)展。在鹽堿地區(qū)，利用轉(zhuǎn)基因手段來(lái)獲得高耐鹽的轉(zhuǎn)基因水稻，推廣具有廣泛適應(yīng)性的水稻耐鹽優(yōu)異品種，是開(kāi)辟鹽堿荒地和水稻增產(chǎn)的一個(gè)新增長(zhǎng)點(diǎn)，目前運(yùn)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因水稻方法之一是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)

2、化法。研究建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)耐鹽基因高效水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有重要理論和實(shí)際指導(dǎo)意義。根據(jù)外源基因是耐鹽基因的特點(diǎn)，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)無(wú)選擇標(biāo)記耐鹽基因水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻商品化應(yīng)用具有重大意義，避免了抗性標(biāo)記基因可能存在對(duì)食品和生態(tài)環(huán)境的潛在危害。
　　 制約農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻效率的主要因素是周期長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化受體的狀態(tài)。本文從這兩方面入手，建立高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻系統(tǒng)。根據(jù)外源基因是耐鹽基因，探討NaCl作為篩選劑可行性，但傳統(tǒng)確定NaC

3、l篩選濃度需要繪制NaCl濃度梯度對(duì)愈傷組織增重率之間的生長(zhǎng)曲線。此過(guò)程比較繁瑣且容易造成污染和誤差。探討利用NaCl對(duì)水稻種子發(fā)芽率的抑制效果作為確定水稻耐鹽基因轉(zhuǎn)化中愈傷組織篩選所需NaCl使用濃度的可行性，同時(shí)比較NaCl與潮霉素的篩選效果。最后，將兩者有機(jī)結(jié)合，對(duì)不同類型的耐鹽基因進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)無(wú)標(biāo)記高效轉(zhuǎn)化水稻，證明該系統(tǒng)是完全可行和有效的。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)快速誘導(dǎo)水稻愈傷組織的建立
　　 在3

4、2℃暗培養(yǎng)7天誘導(dǎo)水稻愈傷組織的快速誘導(dǎo)系統(tǒng)，日本晴、秀水11、，春江06的出愈率均在60％以上，分別是92.87％、82.63％、64.83％;在28℃光培養(yǎng)7天誘導(dǎo)水稻愈傷組織的快速誘導(dǎo)系統(tǒng)，日本晴、秀水11、春江06的出愈率均在70％以上，分別是95.5％、93.07％、74.87％。愈傷表面突起，呈淡黃色，具有活力，完全符合轉(zhuǎn)化的要求，從傳統(tǒng)的愈傷組織誘導(dǎo)需要15天縮短到7天。
　　 (2)高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的建立<

5、br>　　 采取熱激處理，中華11、秀水11、春江06轉(zhuǎn)化效率提高率分別在58.50％、21.96％、27.85％;液體共培養(yǎng)感染，三種水稻轉(zhuǎn)化率提高有60.57％、23.54％、25.17％，建立高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻。
　　 (3)簡(jiǎn)便獲得NaCl有效篩選濃度法的建立
　　 根據(jù)常規(guī)的NaCl濃度梯度對(duì)愈傷組織增重率之間的生長(zhǎng)曲線，確定愈傷組織增重抑制率為80％左右的NaCl濃度為合適的篩選濃度，此相應(yīng)NaCl濃度

6、對(duì)四個(gè)品種水稻種子的發(fā)芽抑制率均達(dá)50％以上。因此，可選取對(duì)水稻種子的發(fā)芽抑制率達(dá)50％以上的NaCl濃度作為耐鹽基因轉(zhuǎn)化中篩選時(shí)NaCl有效濃度的重要參考。
　　 (4)證明轉(zhuǎn)化耐鹽基因中NaCl篩選的有效性和可行性
　　 根據(jù)選取的外源基因?yàn)槟望}基因，以NaCl作為篩選劑，達(dá)到了篩選的目的，對(duì)中華11來(lái)說(shuō)，NaCl篩選下轉(zhuǎn)化率為11.98％，潮霉素篩選下轉(zhuǎn)化率為14.43％;對(duì)秀水11來(lái)說(shuō)，NaCl篩選下轉(zhuǎn)化率為32

7、.06％，潮霉素篩選下轉(zhuǎn)化率為42.64％;對(duì)春江06來(lái)說(shuō)，NaCl篩選下轉(zhuǎn)化率為32.03％，潮霉素篩選下轉(zhuǎn)化率為41.39％，說(shuō)明NaCl篩選效果與潮霉素篩選相近。
　　 (5)安全高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的建立
　　 采用NaCl篩選與高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)秀水11轉(zhuǎn)化效率提高率29.9％，建立安全高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻。
　　 (6)證明安全高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)耐鹽基因轉(zhuǎn)化日本晴的可行性和有效性

8、>　　 選取不同耐鹽機(jī)制的耐鹽基因，將其作為外源基因采用建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)無(wú)選擇標(biāo)記耐鹽基因高效轉(zhuǎn)化水稻系統(tǒng)對(duì)日本晴進(jìn)行轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)表明：BADH、CMO、PKCC的轉(zhuǎn)化效率均在40％以上，分別是44.03％、46.29％、44.68％，證明農(nóng)桿菌介導(dǎo)無(wú)標(biāo)記耐鹽基因高效轉(zhuǎn)化日本晴是可行和有效的。
　　 綜上所述，安全，快速，高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)耐鹽基因轉(zhuǎn)化水稻系統(tǒng)已經(jīng)建立。即32℃光培養(yǎng)7天后，進(jìn)行43℃水浴30min，冰浴1min，