GCH1通過(guò)BH4通路對(duì)快速心房起搏犬自主神經(jīng)重構(gòu)的影響.pdf

1、研究背景及目的
　　心房顫動(dòng)（房顫，AF）是一種臨床上最常見的心律失常之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和療效不佳等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者的健康狀況與生活質(zhì)量。目前房顫的治療主要包括藥物治療、外科手術(shù)及導(dǎo)管射頻消融等，但房顫的治療效果不佳，消融后復(fù)發(fā)率高。這主要與房顫的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，心房重構(gòu)是房顫的重要發(fā)病機(jī)制，主要包括結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)和神經(jīng)重構(gòu)。其中，心臟神經(jīng)重構(gòu)是房顫觸發(fā)和維持的重要因素。心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)分為心臟

2、內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)和外在自主神經(jīng)系統(tǒng)。其中心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)可促使房顫發(fā)作，房顫發(fā)作后使神經(jīng)重構(gòu)更為顯著，二者互相影響，促進(jìn)房顫的維持，然而目前房顫自主神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制并不十分明了。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。近年來(lái)，關(guān)于miRNA在房顫的神經(jīng)重構(gòu)中的作用有了新的認(rèn)識(shí)。已有研究表明，miR-206通過(guò)調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶的表達(dá)促進(jìn)房顫心臟自主神經(jīng)重構(gòu)，證明

3、miR-206在房顫神經(jīng)重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。但miR-206通過(guò)調(diào)節(jié)其他通路對(duì)房顫自主神經(jīng)重構(gòu)的影響目前尚未具體闡明。
　　磷酸鳥苷環(huán)化水解酶1(GCH1)基因編碼的Ⅰ型三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶(guanosine triphosphate cyclohydrolaseⅠ，GTPCHⅠ)是四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin，BH4)從頭合成的限速酶，而BH4是一氧化氮(NO)合成的必需輔因子。先前研究證實(shí)，在動(dòng)物房

4、顫模型中，心肌BH4含量顯著下降，促進(jìn)房顫結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)，而給予外源性BH4補(bǔ)充可以顯著降低房顫誘發(fā)率，證明了BH4參與房顫的重構(gòu)過(guò)程。但目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道BH4通路與房顫自主神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系。
　　本研究通過(guò)建立犬的房顫模型，觀察GCH1在房顫犬心房組織中的表達(dá)變化，及miR-206對(duì)GCH1/BH4通路的影響。并且在犬心房組織中感染GCH1過(guò)表達(dá)慢病毒，觀察GCH1表達(dá)上調(diào)對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用。探討miR-206能否通過(guò)調(diào)控GCH

5、1/BH4通路影響房顫自主神經(jīng)重構(gòu)，為房顫的神經(jīng)重構(gòu)機(jī)制研究提供更多新的思考。
　　材料與方法
　　1.犬房顫模型建立
　　健康成年雜種犬24只，雌雄不拘，體質(zhì)量10～20kg，隨機(jī)分為起搏組(n=6)，起搏+ rniR-206過(guò)表達(dá)組(n=6)，起搏+miR-206沉默組(n=6)和對(duì)照組(n=6)。前三組以400次/min持續(xù)右心房起搏4周。對(duì)照組操作同起搏組，但不打開起搏器開關(guān)。4周后在前三組犬右上脂肪墊(RSF

6、P)中分別注射相應(yīng)慢病毒，處死對(duì)照組動(dòng)物，取RSFP周圍小于0.5cm的心房組織。
　　2.心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)
　　取健康雜種幼犬心房組織，剪成1 mm3左右的組織塊，用膠原酶和胰蛋白酶溶液充分消化后，將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)皿中，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應(yīng)用差速貼壁法分離心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞。
　　3.慢病毒的構(gòu)建
　　構(gòu)建miR-206過(guò)表達(dá)、miR-206沉默、miRNA陰性對(duì)照、GCH1過(guò)表達(dá)、GCH1沉默及

7、GCH1的陰性對(duì)照慢病毒，病毒滴度為1×109TU/ml。
　　4.實(shí)驗(yàn)分組及慢病毒感染
　　4.1慢病毒的在體感染
　　健康成年雜種犬24只，隨機(jī)分為miR-206過(guò)表達(dá)組、miR-206沉默組、GCH1過(guò)表達(dá)組和GCH1沉默組，每組6只。在RSFP中注射相應(yīng)慢病毒，2周后處死。上述三組起搏犬RSFP中注射相應(yīng)慢病毒，其中起搏組犬注射陰性對(duì)照慢病毒，2周后處死。
　　4.2慢病毒的體外感染
　　用miR-

8、206過(guò)表達(dá)、miR-206沉默、GCH1過(guò)表達(dá)和GCH1沉默慢病毒分別感染各組心肌細(xì)胞48h，陰性對(duì)照慢病毒感染對(duì)照組細(xì)胞。
　　5.電生理指標(biāo)檢測(cè)心房有效不應(yīng)期(AERP)
　　通過(guò)多通道程序刺激儀分別于轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染2周后對(duì)miR-206過(guò)表達(dá)組、miR-206沉默組、GCH1過(guò)表達(dá)和GCH1沉默組進(jìn)行電生理檢查，基礎(chǔ)起搏刺激周長(zhǎng)為150ms，S1S2呈8∶1，步長(zhǎng)5ms，AERP定義為S2不引起心房激動(dòng)的最長(zhǎng)S1S2間

9、期。
　　6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)起搏及慢病毒轉(zhuǎn)染后心肌組織和心肌細(xì)胞中GCH1和蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5) mRNA的表達(dá)水平。
　　7.免疫組化分析
　　對(duì)GCH1過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組及GCH1沉默組心肌組織中PGP9.5行免疫組化染色，計(jì)算神經(jīng)密度。
　　8.Western blot檢測(cè)
　　Western blot檢測(cè)起搏及慢病毒轉(zhuǎn)染后心肌組織和心肌細(xì)胞中GC

10、H1和PGP9.5的蛋白表達(dá)水平。
　　9.熒光素酶分析報(bào)告
　　通過(guò)熒光素酶分析報(bào)告驗(yàn)證GCH1是miR-206的靶基因。
　　10.RSFP中NO含量檢測(cè)
　　通過(guò)硝酸還原酶法測(cè)定NO含量。波長(zhǎng)550nm，光徑0.5cm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管OD值。
　　11.RSFP中BH4含量檢測(cè)
　　按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作檢測(cè)，在450 n m波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　

11、結(jié)果
　　1.在起搏組及miR-206過(guò)表達(dá)組中，PGP9.5 mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯上調(diào)，在起搏+miR-206過(guò)表達(dá)組中PGP9.5表達(dá)上調(diào)最明顯。但在miR-206沉默組中，PGP9.5含量明顯下降。
　　2.miR-206過(guò)表達(dá)組AERP明顯縮短，而miR-206沉默組AERP延長(zhǎng)。GCH1過(guò)表達(dá)組AERP明顯延長(zhǎng)，而GCH1沉默組AERP縮短。
　　3.熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了GCH1是miR-206的靶

12、基因。miR-206過(guò)表達(dá)組中GCH1mRNA及蛋白表達(dá)均下降，而miR-206沉默組中GCH1 mRNA及蛋白含量增加。
　　4.miR-206過(guò)表達(dá)組RSFP中BH4和NO含量下調(diào)，而miR-206沉默組中BH4和NO水平明顯升高。GCH1過(guò)表達(dá)組中BH4和NO含量明顯增加，而GCH1沉默使BH4和NO含量減少。
　　5.GCH1過(guò)表達(dá)組中PGP9.5 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，神經(jīng)密度下降。而 GCH1沉默組中PG