心房過表達血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2改善犬心房快速起搏所致的結(jié)構(gòu)重構(gòu)的實驗研究.pdf

1、背景:
　　心房顫動(Atrial Fibrillation，簡稱房顫)是臨床上最常見的心律失常，具有較高的致殘率和致死率，嚴重影響患者生活質(zhì)量。既往研究表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System，RAS)的過度激活，尤其是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中扮演了重要作用。絲裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)直接介導了AngⅡ?qū)π姆拷M

2、織的不良重構(gòu);MAPK磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1，MKP-1)作為雙特異性磷酸酶家族的重要成員，能夠通過其去磷酸化作用直接導致MAPK失活。MAPK和MKP-1的動態(tài)平衡在房顫發(fā)病機制中的作用尚不清楚。
　　血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)是一種羧肽酶，其能夠?qū)⒕哂醒苁湛s效應的AngⅡ轉(zhuǎn)化為擴血管七肽血管緊張素-(1-7)[ANG-(1-7)]，從而起到負性調(diào)節(jié)RAS的作用。最近的研究表明，過表達ACE2能夠

3、拮抗血管緊張素Ⅱ介導的心肌肥厚和間質(zhì)纖維化，防止心功能不全。
　　目的:
　　既往研究已經(jīng)證明心房外膜涂染腺病毒具有較高靶向性和高轉(zhuǎn)染效率。本研究擬通過心外膜涂染血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme2，ACE2)基因的方法探討其預防和改善心房快速起搏模型所致結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響及其分子機制。
　　方法:
　　入選成年健康雜種犬(雌雄不分，20-30Kg)28只，隨機分為Sham

4、組（假手術組）、Control組（對照組）、Ad-EGFP組(心房快速起搏+心房外膜涂染Ad-EGFP)和Ad-ACE2組(心房快速起搏+心房外膜涂染Ad-ACE2)，每組7只。其中假手術組和對照組為空腺病毒，Ad-EGFP組和Ad-ACE2組分別涂抹攜帶有EGFP和ACE2的腺病毒。所有對照組、Ad-EGFP組和Ad-ACE2組的實驗犬均接受心房快速起搏(450次/分)，假手術組不給予心房起搏。2周后，所有實驗犬接受開胸手術操作和心外

5、膜電生理研究(Electrophysiological study, EP)，然后完成心外膜基因涂染?；蜣D(zhuǎn)染后21天，所有動物完成第二次心臟電生理檢查后處死，取動物標本進行組織學和分子生物學研究，如下:
　　1)為探討心房快速起搏所致的組織病理學改變，采用蘇木精-伊紅(HE)和天狼猩紅染色評價。
　　2)為探討過表達ACE2對RAS的影響，本研究采用了實時熒光定量RT-PCR、免疫印跡、ELISA和免疫組化等方法評價了RA

6、S系統(tǒng)成員的表達，如ACE2，AngⅡ和Ang-(1-7)。
　　3)為探討心房外膜過表達ACE2改善心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)可能涉涉及的分子機制，本研究采用蛋白印跡技術評價了MAPK與MKP-1的表達水平及其動態(tài)平衡;采用蛋白印跡技術和實時熒光定量PCR技術評價了轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transtorming growth factor-β1，TGF-β1)和膠原蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　3周后第二次手術與第一次手術時相比較，

7、Control組、Ad-EGFP組和Ad-ACE2組左、右心房的有效不應期(Atrial effective refractoryperiod，AERP)均有顯著性降低，且(AERP350-AERP250)/100（反應AERP頻率適應性）亦顯著降低，Sham組基因轉(zhuǎn)染前后左、右心房的AERP無顯著改變。在房性心律失常的誘發(fā)率與持續(xù)時間方面，Sham組僅能誘發(fā)出短暫房性心律失常;與Sham組和基線相比，Control組和Ad-EGFP組

8、房性心律失常誘發(fā)率顯著增加，且房性心律失常的持續(xù)時間明顯延長;然而，Ad-ACE2組基因轉(zhuǎn)染前后房性心律失常的誘發(fā)率和持續(xù)時間無明顯改變。
　　HE染色未見各組犬發(fā)生嚴重的心包炎癥、滲出和出血。Sham組犬心房肌細胞纖維排列有序，細胞之間的間隙適中。Control組和Ad-EGFP組犬心房肌細胞纖維出現(xiàn)攣縮、斷裂、排列紊亂，天狼星染色提示心房肌間質(zhì)廣泛纖維化，心內(nèi)膜和心外膜纖維組織增厚。相反，與Control組和Ad-EGFP組相

9、比，上述病理異常在Ad-ACE2組明顯減輕，心房肌纖維分布與排列大致有序，心肌間質(zhì)纖維化顯著減輕。
　　纖維化定量分析進一步顯示，Ad-ACE2組心房肌纖維化百分比顯著低于Control組和Ad-EGFP組(5.8±2.4％ vs.11.9±2.3％ vs.14.3±3.4％，P＜0.001)，但與Sham組相比無明顯差異(P=0.614)。
　　Western blot半定量分析結(jié)果:與Sham組相比，Control組和A

10、d-EGFP組ACE2蛋白表達水平顯著降低;然而，Ad-ACE2組ACE2表達水平為Sham組的2倍。進一步地，Relatime RT-PCR結(jié)果顯示ACE2基因的mRNA表達水平在各組之中呈現(xiàn)出與其蛋白表達相一致的趨勢（圖5）。
　　采用免疫組化半定量分析方法評價AngⅡ和Ang-(1-7)在心房組織中的相對表達水平。結(jié)果表明Control組和Ad-EGFP組心房組織中AngⅡ的表達水平顯著高于Sham組和Ad-ACE2組，而C

11、ontrol組和Ad-EGFP組Ang-(1-7)的表達水平較Sham組和Ad-ACE2組更低。ELISA的結(jié)果顯示與上述免疫組化的結(jié)果一致。
　　與Sham組犬相比，Control組和Ad-EGFP組心房組織的p38MAPK、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達水平顯著增加;但與Control組和Ad-EGFP組比較，Ad-ACE2組犬p38MAPK、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達水平顯著降低(P＜0.01)。相反

12、，與Sham組和Ad-ACE2組相比較，Control組和Ad-EGFP組心房組織MKP-1的蛋白表達量顯著降低，且Sham和Ad-ACE2兩組之間心房組織MKP-1的蛋白表達量無顯著差異。
　　Western blot定量分析顯示與Sham組相比，Control組和Ad-EGFP組心房肌組織中TGF-β1和ColⅢ的蛋白表達顯著增加(P＜0.01);而與后兩組比較，過表達ACE顯著降低TGF-β1和ColⅢ的蛋白表達水平。相對應

13、的，與Sham組相比，心房肌組織TGF-β1、Ⅰ和Ⅳ型膠原蛋白的mRNA表達水平在Control組和Ad-EGFP組顯著增加，而與后兩組相比較，過表達ACE2能夠降低TGF-β1和膠原蛋白的mRNA表達水平(P＜0.01)
　　結(jié)論:
　　本研究主要發(fā)現(xiàn):(i)心房過表達ACE2降低房顫誘發(fā)率和縮短房顫持續(xù)時間;(ii)心房過表達ACE2導致心房肌組織局部內(nèi)源性AngⅡ水平的降低和Ang-(1-7)水平的增加，將ACE2/A

14、ng(1-7)/Mas軸與ACE/AngⅡ/AT1R軸之間的平衡向保護性的ACE2/Ang(1-7)/Mas軸移動;(iii)本研究在國內(nèi)外首次證明，心房過表達ACE2顯著降低MAPKs的表達，增加負性調(diào)節(jié)的MAPKs的磷酸酶MKP-1的表達;(iv)心房過表達ACE2明顯改善心房快速起搏所致的心肌纖維化，降低膠原蛋白和促纖維化因子TGF-β1的表達。
　　總之，我們的研究結(jié)果表明，心房外膜轉(zhuǎn)染ACE2可能通過調(diào)節(jié)RAS平衡向保護