微小RNA-1通過(guò)調(diào)節(jié)基因KCNE1和KCNB2的表達(dá)促進(jìn)快速起搏兔心房電重構(gòu)的研究.pdf

1、研究背景：
　　心房顫動(dòng)（房顫AF）是指心房活動(dòng)不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致規(guī)則有序的心房電機(jī)械功能惡化，在心電圖上的表現(xiàn)為P波消失，代之以不規(guī)則的基線(xiàn)波動(dòng)，心室率極不規(guī)則，是最嚴(yán)重的心房電活動(dòng)紊亂之一，具有較高的致病率、致殘率，并導(dǎo)致了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。無(wú)序的顫動(dòng)使心房泵血功能喪失或惡化，加之房室結(jié)對(duì)快速無(wú)序的心房激動(dòng)的遞減傳導(dǎo)，可引起心室極不規(guī)則的興奮，心房收縮力喪失，血流瘀滯易形成栓子。因此心功能受損、心室率（律）紊亂、心房附壁血栓形成等

2、是AF患者的主要病理生理特點(diǎn)。過(guò)去很多實(shí)驗(yàn)室或臨床研究已經(jīng)表明，心房電重構(gòu)(ER)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)(SR)是發(fā)生AF的兩大主要機(jī)制。心房ER主要包括心房有效不應(yīng)期（AERP）及動(dòng)作電位時(shí)程的縮短，動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度減慢，是AF或快速心房率所產(chǎn)生的有利于AF維持和發(fā)生的心房電生理特性的改變。ER發(fā)生在AF過(guò)程的較早期，而SR發(fā)生的相對(duì)較晚。近來(lái)對(duì)編碼特異離子通道蛋白基因的mRNA表達(dá)異常的研究引起了越來(lái)越多的關(guān)注，它可以引起離子通道蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)

3、、性質(zhì)的改變，尤其是鉀離子通道，從而成為ER和心律失常的潛在分子機(jī)制。其中轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)mRNA的調(diào)節(jié)也成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前藥物依然是AF治療的重要方法，藥物能恢復(fù)和維持竇性心律，控制心室率。但是藥物治療的副作用較多如惡心、頭暈、疲勞甚至室性心律失常。AF的非藥物治療包括電轉(zhuǎn)復(fù)、射頻消融治療和外科迷宮手術(shù)治療。電復(fù)律是指用兩個(gè)電極片放置在病人胸部的適當(dāng)部位，通過(guò)除顫儀發(fā)放電流，重新恢復(fù)竇性心律的方法。電復(fù)律不是一種根治AF的方法，A

4、F往往會(huì)復(fù)發(fā)，而且部分患者仍需要繼續(xù)服用抗心律失常藥物維持竇性心律。導(dǎo)管消融治療及外科迷宮手術(shù)都屬于有創(chuàng)治療，易并發(fā)感染及血栓形成等。因此，要找到一個(gè)高效、安全的新策略用于治療AF是非常重要的。
　　MicroRNA(miRNA)是小RNA中的一個(gè)大家族，最早是Lee等人在線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，其在果蠅、植物和哺乳動(dòng)物等真核生物中均有所發(fā)現(xiàn)。因?yàn)樗趧?dòng)植物體內(nèi)發(fā)揮著重要且廣泛的調(diào)控作用，日漸成為人們新的研究熱點(diǎn)。miRNA為一類(lèi)內(nèi)源性非編碼

5、的單鏈小RNA，通過(guò)與其5'端“種子序列”與目的基因mRNA的3'非翻譯區(qū)完全或不完全性互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)目的基因mRNA的堿基進(jìn)行切割或抑制翻譯，指導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)來(lái)調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。新進(jìn)的研究表明miRNA不僅調(diào)控發(fā)育，而且在造血、細(xì)胞增殖和死亡等方面發(fā)揮作用，另外對(duì)心肌肥厚、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化和心律失常等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的影響。
　　MiRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，可以對(duì)

6、編碼特異離子通道蛋白基因的mRNA表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而使離子通道蛋白及連接蛋白過(guò)度表達(dá)或低表達(dá)，致使離子通道平衡失調(diào)，誘發(fā)心律失常。miRNA的表達(dá)具有組織特異性，如在心肌富含miR-1，let-7，miR-133，miR-126-3p，miR-30c，而動(dòng)脈平滑肌富含miR-145，let-7，miR-125b，miR-125a，miR-23和miR-143，但miR-i與miR-133在其中也有表達(dá)。miR-1與miR-133被認(rèn)為是

7、肌肉特異性miRNA，在成人的心臟及骨骼肌中優(yōu)先表達(dá)?，F(xiàn)在的研究認(rèn)為miR-1在許多心臟疾病中扮演重要角色，特別是心律失常的病理生理過(guò)程。Yang等研究發(fā)現(xiàn):梗死小鼠心臟內(nèi)過(guò)量表達(dá)miR-1可以導(dǎo)致心律失常。miR-1通過(guò)作用于基因GJA1和KCNJ2減少心肌Cx43，Kir2.1蛋白的表達(dá)，使減慢傳導(dǎo)，降低了心肌內(nèi)向整流鉀離子電流(IK1)，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，促使發(fā)生快速性心律失常，心電圖中表現(xiàn)為QRS波增寬，QT間期延長(zhǎng)。而miR-

8、1通過(guò)反義寡核苷酸(AMO-1)被移除后，心律失常的發(fā)生明顯減少。由此可知miR-1通過(guò)引起心肌缺血時(shí)離子通道失衡而達(dá)到其致心律失常作用。近來(lái)在Terentyev等人的研究中發(fā)現(xiàn)miR-1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子流來(lái)參與心律失常的發(fā)生。因此，miR-1被認(rèn)為是治療心律失常的新靶點(diǎn)。
　　雖然miR-1在心律失常病理生理過(guò)程中的作用已經(jīng)有所研究，但是miR-1在AF早期ER中所發(fā)揮的機(jī)制至今還沒(méi)有報(bào)道。目前miRNA-1在體轉(zhuǎn)染的研究中

9、大部分選小鼠為動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)染后將心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)其對(duì)應(yīng)的離子通道蛋白含量的變化，但在大型動(dòng)物模型中進(jìn)行miRNA-1在體轉(zhuǎn)染的研究較為少見(jiàn)，而大型動(dòng)物如犬、兔等AF的發(fā)生發(fā)展過(guò)程更接近于人類(lèi)，且在體轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)動(dòng)物模型AF的維持與誘發(fā)等觀(guān)察更直接，因此，我們選擇新西蘭大白兔做為AF模型來(lái)探討相關(guān)miRNA-1的參與機(jī)制，有助于我們更好理解人類(lèi)AF發(fā)生的機(jī)制。雖然新西蘭大白兔的miRNA序列還沒(méi)有納入miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中，

10、但我們?cè)贓nsembl數(shù)據(jù)庫(kù)（http://asia.ensembl.org/Oryctolagus_cuniculus/Info/Index）中找到新西蘭大白兔的基因序列草圖，可用軟件分析出其miR-1的序列。據(jù)此，本課題組擬以快速心房起搏兔為研究模型，以miR-1為候選miRNA，活體心房?jī)?nèi)注射轉(zhuǎn)染miR-1及AMO-1，檢測(cè)miR-1在快速心房起搏兔模型心房肌中的表達(dá)及鉀離子通道蛋白含量及其編碼mRNA的變化，以闡明miR-1參與

11、AF的發(fā)展與維持，為AF的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　研究目的：
　　1.評(píng)價(jià)miR-1在快速起搏1周后在兔心房肌中表達(dá)水平的變化;
　　2.明確miR-1的異常表達(dá)與快速起搏兔心房早期ER的關(guān)系;
　　3.探究miR-1促進(jìn)心房早期ER的潛在分子機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.動(dòng)物模型建立
　　1.1、動(dòng)物分組
　　選購(gòu)健康新西蘭大白兔24只，雌雄不拘，體重1.5-2.5kg，隨機(jī)分為4組

12、，各組6只。其中第1組設(shè)為假手術(shù)，第2組設(shè)為快速起搏組，第3組設(shè)為起搏+miRNA-1轉(zhuǎn)染組，第4組設(shè)為起搏+AMO-1轉(zhuǎn)染組。
　?、偌偈中g(shù)（第1組，n=6），埋置起搏器不予起搏，1周后開(kāi)胸，右房(RA)心肌內(nèi)注射對(duì)照病毒，1周后處死;
　　②心房快速起搏組（第2組，n=6），埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開(kāi)胸，RA心肌內(nèi)注射對(duì)照病毒，1周后處死;
　?、坌姆靠焖倨鸩?miR-1轉(zhuǎn)染組（第3組，n=6

13、），埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開(kāi)胸，RA心肌內(nèi)注射miR-1，1周后處死;
　　④心房快速起搏+miR-1轉(zhuǎn)染組（第4組，n=6），埋置起搏器以起搏頻率600bpm連續(xù)起搏1周。開(kāi)胸，RA心肌內(nèi)注射AMO-1，1周后處死。
　　1.2、快速心房起搏模型建立
　　先用3％戊（苯）巴比妥鈉(30-35mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈將新西蘭大白兔麻醉，繼以氟烷(2-3％)及一氧化二氮(60-75％)維持麻醉狀態(tài)(

14、28)，仰臥位固定動(dòng)物，氣管插管，呼吸機(jī)機(jī)械通氣，調(diào)節(jié)呼吸頻率30-50bpm，每分通氣量15-40ml，吸呼比為2∶1。胸頸部用利多卡因局麻并脫毛、常規(guī)消毒、鋪巾，切開(kāi)右頸部皮膚、分離皮下組織，暴露右頸內(nèi)靜脈，送入“J”形心房單電極，在X線(xiàn)透視下將電極頭端固定于右心耳，整個(gè)過(guò)程都遵守?zé)o菌操作。
　　2.電生理指標(biāo)檢測(cè)
　　電生理檢查通過(guò)多通道程序刺激儀分別于起搏前、轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染1周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，并由電生理記錄系統(tǒng)記錄下R

15、A心內(nèi)心電圖。AERP的測(cè)定采用S1S2反向掃描刺激法，S1S2呈8∶1，步長(zhǎng)5ms，基礎(chǔ)起搏刺激周長(zhǎng)分別為150、130ms，AERP定義為S2不引起心房激動(dòng)的最長(zhǎng)S1S2間期。AF由S1S2程序刺激或者burst刺激誘發(fā)。
　　3.構(gòu)建和生產(chǎn)慢病毒
　　新西蘭大白兔miR-1和AMO-1的前體序列由TELEBIO公司構(gòu)建，慢病毒滴度為1×109TU/ml。
　　4.在體基因轉(zhuǎn)染
　　在快速起搏1周后，右胸第4

16、肋間打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟并剝離心包，將慢病毒復(fù)合物多點(diǎn)斜行注射到快速心房起搏兔RA前壁，關(guān)胸。一周后處死，立即取出心臟用PBS液由主動(dòng)脈根部逆行灌注，然后分離出RA，拭干后保存在-80℃有待下一步使用。
　　5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR
　　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)miR-1和KCNE1/KCNB2mRNA表達(dá)水平。
　　6.Western blot檢測(cè)
　　Western blot檢測(cè)KCNE1和KCNB

17、2所編碼的離子通道蛋白表達(dá)水平。
　　7.熒光素梅報(bào)告分析
　　通過(guò)熒光素梅報(bào)告分析證實(shí)KCNE1和KCNB2是miR-1的靶基因。
　　結(jié)果：
　　1.在快速起搏1周后，兔RA可發(fā)現(xiàn)早期ER;
　　2.在快速起搏1周后，miR-1的表達(dá)水平發(fā)生上調(diào);
　　3.通過(guò)轉(zhuǎn)染外源基因使miR-1過(guò)表達(dá)，促進(jìn)了心房ER的發(fā)生，應(yīng)用AMO-1拮抗miR-1后可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象;
　　4.KCNE1和KCNB2

18、是miR-1的靶基因，他們的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　MiR-1通過(guò)作用于其靶基因KCNE1和KCNB2來(lái)調(diào)節(jié)后者編碼的鉀離子通道蛋白，從而影響心臟鉀離子通道及電流，參與了由快速起搏引起的早期心房ER，表明miR-1可能在AF的發(fā)生過(guò)程中起到重要的作用。因此，miR-1作為治療AF的潛在靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。
　　創(chuàng)新性：
　　1.用新西蘭大白兔制作快速心房起搏動(dòng)物模型并檢測(cè)miR-1在心房細(xì)胞中的表

19、達(dá)變化;
　　2.心房肌內(nèi)活體注射miR-1及AMO-11周后體外檢測(cè)離子通道蛋白及其編碼基因的變化，探討miR-1對(duì)鉀離子通道及心房ER的影響及意義。
　　局限性：
　　1.迄今為止，已有數(shù)千個(gè)microRNA分子先后在生物體內(nèi)被鑒定，我們只進(jìn)行了miR-1對(duì)心房早期ER的研究。
　　2.同一種miRNA在不同的AF類(lèi)型或在AF的不同時(shí)期發(fā)揮作用的不盡相同，我們只研究了miR-1對(duì)快速起搏兔右心房早期ER的影響